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1. Mantenimento della coltura cellulare microgliale
- Terreno di coltura cellulare caldo (Dulbecco's Modified Eagle Medium; DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina/neomicina (PSN) a 37 °C.
- Ottenere uno stock congelato di cellule microgliali BV2 al passaggio 18 - 25 dallo stoccaggio a -80 °C. Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Trasferire delicatamente le cellule in un pallone ventilato da 75 cm2 contenente 10 ml di terreno di coltura cellulare.
- Incubare il pallone in CO2 al 5% a 37 °C. Aspirare il terreno dopo 24 ore e sostituirlo con terreno nuovo. Far crescere le cellule fino a circa il 70 - 80% di confluenza.
2. Conteggio e placcatura delle celle
- In un bagno d'acqua a 37 °C, scaldare la soluzione di DMEM e 1x-tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA).
- Aspirare i terreni dalle cellule e aggiungere 500 μl di tripsina. Incubare a 37°C per 2 - 5 min.
- Utilizzando un raschietto, rimuovere le cellule dal pallone e sospenderle in 5 ml di DMEM. Far passare tre volte le cellule attraverso un colino da 70 μm in una provetta da 50 ml.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 8.000 cellule/pozzetto in una piastra a fondo trasparente a parete nera in un volume finale di 200 μl di DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di PSN. Incubare la piastra in CO2 al 5% a 37 °C per 24 ore.
- Rimuovere il vecchio DMEM e sostituirlo con 200 μl di DMEM riscaldato integrato con l'1% di PSN per sierizzare la microglia affamata. Incubare la piastra in CO2 al 5% a 37 °C per 24 ore.
3. Attivazione della Microglia
- In provette separate, diluire le nanoparticelle d'argento (AgNP) (0,01, 0,05 o 0,1 μg/ml) e il controllo veicolo/neutro (citrato di sodio, 0,04 mM) in DMEM privo di siero integrato con l'1% di PSN alle concentrazioni finali di lavoro.
- Rimuovere 100 μl di terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con 100 μl di composto di trattamento appropriato.
- Incubare la piastra in CO2 al 5 % a 37 °C per 24 ore.
4. Filtrare i Media Condizionati
- Raccogliere 200 μl di surnatante da ciascun pozzetto e trasferirlo in un filtro (taglio del peso molecolare di 10 kDa) con provetta di raccolta (capacità da 1,5 a 2 ml).
- Centrifugare a 14.000 x g a temperatura ambiente per 15 min.
- Scartare il flusso passante (surnatante con particelle) e posizionare il filtro capovolto in una nuova provetta di raccolta.
- Centrifugare a 1.000 x g a temperatura ambiente per 2 min.
nota: Il terreno filtrato risultante (contenente citochine secrete) è concentrato sei volte.
- Portare il volume del concentrato a 400 μl con DMEM fresco integrato con il 10% di FBS e l'1% di PSN e conservare in ghiaccio.
5. Mantenimento della coltura cellulare ipotalamica
- Terreno di coltura cellulare DMEM caldo integrato con il 10% di FBS e l'1% di PSN a 37 °C.
- Procurarsi una riserva congelata di cellule ipotalamiche (mHypo-A1/2) al passaggio 18 - 25 conservate a 80 °C. Scongelare rapidamente le cellule in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Trasferire delicatamente le cellule in un pallone ventilato da 75 cm2 contenente 10 ml di terreno di coltura cellulare.
- Incubare il pallone in CO2 al 5% a 37 °C. Aspirare il terreno dopo 24 ore e sostituirlo con terreno nuovo. Far crescere le cellule fino a quando non raggiungono circa il 70-80% di confluenza.
6. Determinazione della tossicità delle cellule ipotalamiche
- Scaldare la soluzione di DMEM e 1x-tripsina-EDTA in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Aspirare i terreni dalle cellule ipotalamiche e aggiungere 500 μl di tripsina. Incubare a 37 °C per 2 - 5 min. Rimuovere le celle dal pallone utilizzando un raschietto, come descritto sopra al punto 2.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e le cellule ipotalamiche su piastra a 5.000 cellule/pozzetto in una piastra a fondo trasparente a parete nera in un volume finale di 200 μl di DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di PSN, e incubare per una notte in CO2 al 5% a 37 °C.
- Rimuovere 100 μl di vecchio terreno utilizzando un pipettatore multicanale e aggiungere 100 μl di terreno condizionato concentrato filtrato a una concentrazione finale di 1x.
- Incubare la piastra in CO2 al 5% a 37 °C per 24 ore.
- Aggiungere 22 μl di reagente resazurina e incubare la piastra per 20 minuti in CO2 al 5% a 37 °C.
- Utilizzando uno spettrofotometro multimodale, è possibile registrare la fluorescenza (560 nm EX/590 nm EM) per misurare la vitalità cellulare. Riportare i risultati come unità di fluorescenza relativa (RFU).