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1. Preparazione dei reagenti e delle attrezzature
- Preparare 1 tampone di dissezione (70 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,02 mM CaCl2, 20 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 115 mM saccarosio, 5 mM trealosio, 5 mM idrossietilpiperazina etano acido solfonico [HEPES]; pH 7,2).
- Preparare 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Prepara 1x PBT usando 1x PBS con 0,01% di Triton X-100.
- Preparare piastre di agar per succo di frutta.14 Brevemente, mescolare 30 g di agar in 700 ml di H2O e in autoclave. Sciogliere 0,5 g di metilparabene in 10 mL di etanolo e aggiungere la soluzione a 300 mL di concentrato di succo di frutta (uva o mela). Mescolare il concentrato in una soluzione di agar autoclavata e versare nei coperchi delle piastre di Petri da 10 mm x 35 mm.
nota: Il premix di energia per agar d'uva può essere acquistato anche da varie aziende (vedi Tabella dei materiali).
- Procurati una pinza di misura 5 che ti permetta di ferire meccanicamente le larve.
- Utilizzare un apparecchio per anestesia standard a base di Drosophila CO2.
2. Selezione delle larve di Drosophila
- Prendere una fiala o un flacone di Drosophila contenente larve vaganti del terzo stadio che sono state coltivate a 25 °C.
- Seleziona dieci larve individuali di 2° o 3° stadio in base all'aspetto. Le larve del terzo stadio possono essere identificate dall'aspetto di spiracoli ramificati anteriori, mentre le larve del secondo stadio sono più piccole e hanno spiracoli anteriori più simili a clava.
nota: Gli stadi larvali possono anche essere identificati dai tempi. A 25 °C, le larve del secondo stadio compaiono circa 48 ore dopo la schiusa e le larve del terzo stadio fanno la muta circa 24 ore dopo. Se interessati a esaminare la neurodegenerazione al NMJ, le larve del secondo stadio devono essere ferite.
3. Preparare le larve di Drosophila per le lesioni meccaniche
- Raccogli con cura le singole larve con una pinza o un pennello, facendo attenzione a non comprimerle in alcun modo.
- Metti direttamente dieci larve in una capsula di vetro contenente 1X PBS freddo o tampone di dissezione per rimuovere eventuali residui di cibo e decelerare la motilità larvale.
4. Lesioni meccaniche e trattamento delle larve di Drosophila
- Posizionare ogni singola larva su un apparecchio anestetizzante di CO2.
- Sotto un microscopio da dissezione, arrotolare con cura ogni larva sul lato dorsale per visualizzare i nervi segmentali attraverso la cuticola.
- Posizionare la pinza di 5 a circa 1/2 a 2/3 lungo la lunghezza della larva a partire dai ganci della bocca. Una volta posizionato, pizzicare circa 1/3 della cuticola ventrale contenente i nervi segmentali con una pinza di misura 5.
- Per garantire che i nervi segmentali larvali siano danneggiati, applicare una forza sufficiente per schiacciare i nervi segmentali ma lasciare intatta la cuticola. Per determinare la corretta quantità di forza, schiacciare 10 larve e assicurarsi che il tasso di mortalità dopo 5 ore sia inferiore al 50%.
- Dopo la lesione, trasferire con cura le larve in una piastra di agar per succo di frutta contenente circa 0,5 g di pasta di lievito. Posizionare ogni larva in modo che la sua estremità anteriore sia sulla pasta di lievito, per continuare l'alimentazione nonostante la motilità interrotta><.
nota: Per garantire che i nervi segmentali larvali siano stati danneggiati, è possibile osservare un'interruzione della motilità larvale dopo il trasferimento alla piastra di agar. Le larve ferite sono effettivamente paralizzate posteriormente al sito della lesione, ma possono ancora muovere i ganci della bocca e nutrirsi. Un alto tasso di mortalità degli animali dopo un infortunio è comune, quindi è meglio ferire il 20-50% in più di animali di quanto sia necessario per un esperimento.
- Posizionare le piastre di agar contenenti pasta di lievito e 10 larve ferite sul fondo di una capsula di Petri vuota di 100 x 15 mm. Copri questa piastra di Petri, che ora contiene le larve ferite, su una piastra di agar con un tovagliolo di carta umido, assicurandoti che il tovagliolo di carta non tocchi le larve o le piastre di agar. Metti questa capsula di Petri in un contenitore ermetico più grande, a temperatura ambiente (RT).
- Recuperare le larve per la dissezione dopo periodi specificati (6, 12 o 24 ore) dopo la lesione.
nota: Per esaminare gli effetti immediati della lesione sul citoscheletro assonale, le larve possono essere sezionate direttamente dopo la lesione. Per esaminare i difetti di trasporto assonale, le larve possono essere sezionate circa 6 ore dopo la lesione. Circa 12 ore dopo la lesione si può osservare un accumulo di proteine ubiquitinate e 24 ore dopo la lesione si può osservare la degenerazione dei motoneuroni a livello della NMJ.