Generazione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

Abstract

Fonte: Tietz, S. M. et al. Visualizzazione della compromissione delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. (2019)

Questo video mostra il metodo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) iniettando peptidi derivati dalla mielina con un adiuvante per attivare le cellule T autoreattive, che migrano verso il cervello. La tossina della pertosse viene somministrata per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo a queste cellule T e ad altre cellule immunitarie di entrare nel cervello. Queste cellule immunitarie causano demielinizzazione, portando a una compromissione della trasmissione nervosa e allo sviluppo di EAE.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Induzione EAE

1. Anestetizzare i topi C57BL/6 con isofluorano utilizzando un sistema di vaporizzazione. Per indurre l'anestesia nei topi, esporre il topo al 4,5% di isofluorano in ossigeno in una piccola camera di incubazione prima di trasferire il topo in una maschera facciale con isofluorano al 2,1%. Utilizzare un'unità di anestesia dotata di un termoforo per prevenire l'ipotermia del topo.
2. Fissare il topo anestetizzato in una mano e iniettare prima 30 μL di glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG)-peptide aa_35-55 (MOG_35-55)/ emulsione completa dell'adiuvante di Freund (CFA) per via sottocutanea nei fianchi delle zampe posteriori (Figura 1: 1 + 2; in totale 60 μL; fianco sinistro 30 μL e fianco destro 30 μL) in prossimità dei linfonodi inguinali.
3. Posizionare il topo sulla pancia e iniettare 20 μL di emulsione di MOGaa_35-55/CFA nel tessuto adiposo molle sinistro e destro alla radice della coda (Figura 1: 3 + 4; in totale 40 μL; radice della coda sul lato sinistro 20 μL e radice della coda sul lato destro 20 μL) e una piccola goccia di emulsione di MOGaa_35-55/CFA nel collo del topo (Figura 1: 5).
4. Iniettare 100 μL di soluzione di tossina della pertosse (PTx) per via intraperitoneale nel topo. Tenere la testa del topo sotto il centro del corpo per evitare l'iniezione nell'intestino.
5. Sostituire la dieta di mantenimento (estrudere i principali nutrienti: proteina grezza 18,5%; grassi grezzi 4,5%; fibra grezza 4,5%; ceneri grezze 6,5%; amido 35%; energia metabolica: 13,1 MJ/kg) alla dieta riproduttiva (estrudere i principali nutrienti: proteina grezza 23,5%; grassi grezzi 5,5%; fibra grezza 3%; ceneri grezze 5,7%; amido 36%; energia metabolica: 14,3 MJ/kg) al fine di fornire ai topi cibo con un contenuto energetico più elevato prima e durante la malattia clinica prevista.
6. Rimuovi la maschera facciale e trasferisci il mouse nella sua gabbia domestica con un tappetino riscaldante. Dopo 10 minuti, assicurati che il mouse sia completamente sveglio e mobile.
7. Ripetere l'iniezione di PTx (passaggio 1.4) 48 ore dopo il primo trattamento.

2. Punteggio dei mouse EAE

1. Controlla lo stato di salute dei topi EAE ogni mattina dando un'occhiata all'interno delle gabbie.
2. Segna i topi EAE ogni pomeriggio.
3. Prendi ogni singolo mouse incluso nell'esperimento EAE fuori dalla gabbia e controlla se la coda ha tono spostandola verso l'alto con un dito. Un topo sano terrà la coda alzata (la coda ha un tono). Se l'EAE clinico è iniziato, il tono della coda sarà più basso, visibile da un graduale abbassamento della coda. Alla fine, il topo non sarà in grado di sollevare affatto la coda.
4. Posiziona ogni singolo mouse incluso nell'esperimento EAE sul banco pulito e osserva e documenta il comportamento di camminata. Vedere la Tabella 1 per i criteri di punteggio per la valutazione della gravità della malattia (il punteggio EAE).
5. Valutare e documentare il peso di ogni topo incluso nell'esperimento.
6. Per garantire un adeguato assorbimento di cibo e acqua da parte dei topi che mostrano un punteggio EAE clinico di 1, fornire cibo inumidito in un piatto di plastica sul fondo della gabbia e rinfrescare quotidianamente.

Results

Figura 1: Rappresentazione grafica dei siti di iniezione per l'induzione di EAE. 1) sito di iniezione di emulsione MOG da 30 μL nel fianco destro, 2) sito di iniezione di emulsione MOG da 30 μL nel fianco sinistro, 3) sito di iniezione di emulsione MOG da 20 μL nella radice della coda sinistra, 4) sito di iniezione di emulsione MOG da 30 μL nella radice della coda destra, 5) sito di iniezione per un...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cibo per l'allevamento	ad es. PROVIMI KLIBA SA	Telefono 3336
Gabbie ventilate individualmente, Blue line Tipo II o III	es. Tecniplast	1145T, 1285L
Topi femmina C57BL/6J (8-12 settimane)	ad esempio Janvier Labs		Femmine, 8-12 settimane
Ago per iniezione 18G x 11/2" (1,2 mm x 40 mm)	ad es. BD, BD Microlance 3	304622
27G x 3/4'' – Nr. 20 (0,4 mm x 19 mm) ago per iniezione	ad es. BD, BD Microlance 3	Codice 302200
Ago per iniezione da 30 G x 1/2" (0,3 mm x 13 mm)	ad es. BD, BD Microlance 3	Codice 304000
Coadiuvante di Freund incompleto (IFA)	ad esempio Santa Cruz Biotechnology	SC-24648	Conservare a 4°C
Alimenti di mantenimento	ad es. PROVIMI KLIBA SA	Telefono 3436
Peptide MOGaa35-55	ad esempio GenScript		Conservare a -80 °C
Mycobacterium tuberculosis H37RA	ad es. BD	231141	Conservare a 4 °C
NaCl 0,9 %	B. Braun	3535789
Omnican 50 30G x 1/2''	B. Braun	9151125S
Tossina della pertosse	ad es. Elenco laboratori biologici, Inc.	180	Conservare a 4 °C
Forbice per punti	F.S.T	Codice: 15012-12
siringa 1 ml	es. PRIMO	62.1002
siringa 10 ml	ad es. CODAN Medical ApS	Anno 2022-05