Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Saggio di permeabilità in vivo
- Preparazione delle soluzioni:
- Per le soluzioni madre di destrano, sciogliere 10 mg di destrano da 10 kDa Alexa Fluor 488 e 3 kDa di destrano Texas Red in 500 μl di soluzione di cloruro di sodio allo 0,9% (20 mg/mL).
- Per la soluzione di lavoro del destrano, poco prima dell'iniezione pipettare 55 μL di 10 kDa di destrano Alexa Fluor 488 soluzione madre (20 mg/mL) su un pezzo di pellicola sigillante e aggiungere 55 μL di 3 kDa destrano Texas Red soluzione madre (20 mg/mL). Mescolare e raccogliere 100 μl in una siringa fine monouso (concentrazione finale 2 mg/100 μl).
- Per la soluzione madre di formaldeide al 10% (Paraformaldeide o PFA), combinare 10 g di polvere extra pura di PFA, 100 ml di PBS e 200 μl di idrossido di sodio 1N (NaOH) in un becher di vetro pulito e riscaldare a 56 °C esatti sotto agitazione utilizzando un agitatore magnetico. Mantenere a 56 °C per 30 minuti fino a quando il PFA non si è completamente sciolto. Raffreddare a temperatura ambiente, regolare il pH a 7,4 e filtrare con un filtro di carta. Conservare a—20 °C. La soluzione madre può essere ulteriormente diluita utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato o PBS.
- Anestetizzare brevemente topi sani C57BL/6 o topi C57BL/6 affetti da encefalomielite autoimmune sperimentale, o EAE con isoflurano (il topo sarà sedato per circa 1 minuto). Utilizzare un sistema automatizzato (i topi saranno esposti al 4,5% di isoflurano in ossigeno in una camera di induzione e poi trasferiti in una maschera facciale con isoflurano al 2,1%).
- Posizionare il topo anestetizzato in posizione laterale sul tavolo, quindi iniettare per via endovenosa (ad es. retro-orbitale) 100 μL di traccianti fluorescenti nel topo prima che il topo si svegli
.
- Rimuovere immediatamente la maschera facciale e assicurarsi che il topo sia completamente sveglio e mobile dopo la breve anestesia. Lasciare circolare il tracciante per 15 minuti.
