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Disclaimer text: Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Colorazione in immunofluorescenza
- Estrarre i vetrini da -80 °C. Mantenere i vetrini a RT per 1 ora per asciugare le sezioni all'aria. Sciacquare i vetrini in PBST allo 0,1% (0,1% di terz-ottilfeniletere di polietilenglicole in PBS; vedere la Tabella dei materiali) tre volte per 5 minuti ciascuna per lavare l'OCT e permeabilizzare le sezioni.
- Facoltativamente, eseguire il recupero dell'antigene (opzionale).
- Preriscaldare il tampone citrato (10 mM di citrato di sodio pH 6) nella piastra di colorazione con una vaporiera o un bagnomaria a 95-100 °C. Immergere i vetrini nel tampone citrato e incubare per 10 minuti.
- Estrarre la vaschetta di colorazione dalla vaporiera o dal bagnomaria e raffreddare i vetrini a temperatura ambiente per 20 minuti o più15.
nota: In alternativa, utilizzare il tampone Tris-EDTA (10 mM di base Tris, 1 mM di EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9,0) o il tampone EDTA (1 mM di EDTA, 0,05% Tween 20, pH 8,0) per il recupero dell'antigene indotto dal calore. Utilizzare una pentola a pressione, un forno a microonde o un bagnomaria per il recupero dell'antigene indotto dal calore oltre alla vaporiera calda. Un'altra alternativa è il recupero dell'antigene indotto da enzimi utilizzando tripsina o pepsina. Ottimizza la concentrazione e il tempo di trattamento del recupero enzimatico per evitare di danneggiare le sezioni. Ottimizzare il metodo di recupero dell'antigene per ogni combinazione anticorpo/antigene.
- Incubare ogni vetrino con 200 μL di soluzione bloccante (5% di siero d'asina diluito in 0,1% PBST) a RT per 30 minuti, quindi rimuovere la soluzione bloccante senza risciacquare.
- Incubare ciascun vetrino con 100 μL di anticorpo primario o anticorpi diluiti in soluzione bloccante per 1 ora a RT o O/N a 4 °C. Sciacquare i vetrini con PBS tre volte per 10 minuti ciascuno a RT.
- Incubare ciascun vetrino con 100 μL di anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante per 1 ora a RT. Sciacquare i vetrini in PBS tre volte per 10 minuti ciascuno a RT. Proteggere i vetrini dalla luce.
- Montare le diapositive.
- Aggiungere due gocce di terreno anti-sbiadimento con DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindolo) sul vetrino. Quindi coprire con un vetrino coprioggetti.
- Conservare a 4 °C al buio fino al momento dell'imaging.
nota: In alternativa, etichettare i nuclei con DAPI o colorante Hoechst 33324 diluito 1:2.000 in PBS prima a RT, quindi montare con glicerolo.