Visualizzazione delle motilità delle vescicole nei neuroni mediante imaging a fluorescenza

Abstract

Fonte: Tsuruta, F., et al. Quantificazione delle motilità di endosomi e lisosomi nei neuroni in coltura utilizzando sonde fluorescenti. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video dimostra come le vescicole neuronali siano marcate con specifiche proteine fluorescenti per visualizzare il loro movimento. In primo luogo, un plasmide codificante per una proteina fluorescente viene incubato con un agente di trasfezione e quindi introdotto in una coltura di neuroni. Successivamente, le immagini dei neuroni vengono acquisite e analizzate per tracciare il movimento delle vescicole.

Protocol

1. Imaging della motilità delle vescicole

1. Prepara i plasmidi che etichetteranno ogni tipo di vescicola. Ad esempio, utilizzare EGFP-Rab5 per gli endosomi precoci, EGFP-Rab7 per gli endosomi tardivi, LAMP-EGFP per i lisosomi e EGFP-LC3 per gli autofagosomi.
   nota: Questi plasmidi sono disponibili su richiesta presso tsuruta.fuminori.fn@u.tsukuba.ac.jp. Tipicamente, i neuroni in vitro (Division o DIV) per 3-5 giorni possono essere trasfettati con questi plasmidi utilizzando reagenti di trasfezione.
2. Miscelare 4,0 μg di plasmidi con 200 μl di terreno privo di siero mediante pipettaggio. In una provetta separata, diluire 8 μL di reagente di trasfezione (vedere la Tabella dei materiali) in 200 μl di terreno privo di siero. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
3. Miscelare la soluzione plasmidica e la soluzione reggente di trasfezione nella fase 1.2 mediante pipettaggio. Incubare per 20 minuti a RT.
4. Aggiungere terreno privo di siero e 400 μl della soluzione plasmidica della fase 1.3 a ciascuna piastra rivestita con fondo di vetro contenente neuroni corticali e terreno di coltura corticale cerebrale. Incubare i neuroni a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 30 minuti. Sostituire il terreno con 2 mL di terreno di coltura corticale cerebrale. Incubare i neuroni a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ per 1-2 giorni.
   nota: Preparare un terreno di coltura corticale cerebrale costituito da mezzo basale neuronale integrato con 1 integratore di B-27, 2 mM di L-glutammina e 100 U/mL di penicillina-streptomicina.
5. Dopo 1 - 2 giorni di trasfezione, selezionare le celle trasfettate per l'acquisizione dell'immagine.
   nota: I neuroni prematuri inferiori a 7 DIV hanno la tendenza a mostrare una motilità dinamica delle vescicole. Selezionare i neuroni che esprimono moderatamente la sonda a fluorescenza perché non è possibile ottenere immagini chiare quando viene selezionato un neurone ad alta espressione. Inoltre, selezionare una tipica forma neuronale, come i neuroni piramidali, che hanno assoni lunghi e dendriti intricati, per facilitare l'identificazione dell'assone e dei dendriti (vedi Figura 1A).
6. Acquisizione di immagini utilizzando un sistema di imaging time-lapse: per l'imaging, utilizzare un microscopio a fluorescenza dotato di una fotocamera CCD (Charge-Coupled Device) con obiettivi 40X Plan Apo 0.95NA o 100X Plan Apo VC NA1.4. Controllare la temperatura a 37 °C utilizzando un sistema di incubazione. Acquisizione di immagini neuronali a un fotogramma/5 s per un periodo di 100 s controllato dal software di acquisizione delle immagini. In alternativa, è possibile acquisire immagini a intervalli più brevi e per periodi di tempo più lunghi, ad esempio a un fotogramma ogni 2 s per un periodo di 300 s.
   nota: Sono disponibili una varietà di applicazioni per scattare immagini in sequenza, molte delle quali sarebbero adatte a questo metodo. Pertanto, non è consigliata alcuna applicazione particolare; Invece, ogni ricercatore dovrebbe utilizzare qualsiasi applicazione disponibile.

2. Analisi delle immagini

1. Apertura di tutte le immagini sequenziali nel software ImageJ con l'inseguimento manuale.
   nota: Ad oggi, il tracciamento manuale è stato ampiamente utilizzato negli esperimenti di tracciamento. Il tracciamento manuale è stato sviluppato dal Dr. Fabrice Cordelières. Istruzioni scritte dettagliate sono disponibili online. Per l'analisi, la qualità dei dati di imaging viene migliorata con un numero sufficiente di immagini. Si consiglia di utilizzare più di 20 immagini.
2. Per combinare le immagini in sequenza, seleziona→ → . Clic.
3. Scegli → ; verrà visualizzata una finestra di tracciamento.
4. Fare clic sulla casella di controllo e definire i parametri di tracciamento nella sezione parameters.
   nota: È possibile impostare diversi parametri, tra cui l'intervallo di tempo, la calibrazione x/y, la calibrazione z, la dimensione del quadrato di ricerca per la centratura, la dimensione del punto, la larghezza della linea e la dimensione del carattere. In questo test semplificato, sono stati definiti sia l'intervallo di tempo che la calibrazione x/y. In altre circostanze sperimentali, potrebbe essere necessario definire anche altri parametri. I parametri utilizzati qui sono i seguenti: è 5 s e è 0,26642 μm per un obiettivo 40X Plan Apo 0,95NA o 0,10657 μm per un obiettivo 100X Plan Apo VC NA1.4.
5. Dopo aver definito i parametri, fare clic su per avviare una nuova traccia.
6. Dopo aver determinato le vescicole di interesse (ad esempio, le vescicole indicate dalle punte delle frecce blu e rosse nella Figura 1A (pannello di destra)), fare clic sul centro dei segnali nelle immagini sequenziali per registrare le coordinate xy. I risultati delle coordinate xy registrate, della distanza e della velocità vengono visualizzati in una nuova finestra.
   nota: Nel caso dei lisosomi, nei neuroni si osservano spesso grandi segnali fluorescenti luminosi (ad esempio, Figura 1A (pannello di destra), punta di freccia arancione). Questi segnali mostrano occasionalmente vescicole accumulate o varici patologiche, quindi questi segnali dovrebbero essere evitati per quantificare la motilità.
7. Ripetere il passaggio 2.6 per raccogliere le coordinate xy delle vescicole da tutte le immagini sequenziali; dopo aver selezionato il punto di riferimento, ogni immagine avanza automaticamente all'immagine successiva.
8. Esporta questi dati in una nuova tabella (ad esempio, un foglio di calcolo). Utilizzare un software appropriato per creare un grafico adatto (vedi Tabella dei materiali).
   nota: Per analizzare i dati, selezionare la colonna, sommare tutti i valori di questa colonna e mostrare una distanza di motilità come grafico a barre, come nella Figura 1B. Inoltre, ripetere questo passaggio, calcolare la media della distanza totale di motilità e mostrarla come grafico a barre, come nella Figura 1C. Il software per creare un grafico a barre e i dati della forma d'onda è mostrato nella Tabella dei materiali.

Results

Figura 1: Motilità dei lisosomi nei dendriti neuronali. (A) I neuroni corticali di topo (4 DIV) sono stati trasfettati con plasmide LAMP-EGFP per 2 giorni. Questa immagine mostra la motilità delle vescicole contenenti LAMP-EGFP nei dendriti. Il riquadro mostra l'immagine time-lapse delle vescicole positive LAMP-EGFP. La punta della freccia rossa indica una vescicola in movimento e la punta della frec...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Terreno neurobasale	Thermo Fisher	Codice 21103-049
Opti-MEM	Thermo Fisher	31985070	Terreno privo di siero
Penicilina Streptmicina	Thermo Fisher	15140122
L-Glutammina	Thermo Fisher	25030081
Integratori B-27	Thermo Fisher	17504044
bromidrato di poli-D-lisina	sigma	P7280
poli-L-ornitina	sigma	P4957
Lipofectamina 2000	Thermo Fisher	11668027	Reagente di trasfezione
Polietilenimmina "Max"	Poliscienze	Codice 24765	Reagente di trasfezione. In alternativa alla Lipofectamin2000, è disponibile 0,1 mg/ml di polietilenimmina disciolta in acqua sterilizzata. Ma è a bassa efficienza e ad alta tossicità.
BIOREVO BZ-9000	Keyence	Na
Sistema di incubazione INUG2-K13	Colpo Tokay	Na
GraphPad Prism versione 6.0	Software GraphPad	Na
Excel versione 15	Valentina	Na
ImageJ versione 1.47	Na	Na