Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Immunofluorescenza
- Preparare le soluzioni, compreso il tampone bloccante, il tampone anticorpale, il tampone di lavaggio 1 e il tampone di lavaggio 2 (vedere Tabella 1).
- Sciacquare le fette una volta con tampone fosfato (PB) per rimuovere il composto in eccesso della temperatura di taglio ottimale (OCT).
- Rimuovere la soluzione con una pipetta di plastica senza aspirare le fette di cervello. Aggiungere 250 μl di PB fresco con una pipetta da 1000 μl.
cautela: Le fette non devono seccarsi, quindi rimuoverle e aggiungere bene i liquidi.
- Rimuovere il PB con una pipetta di plastica e aggiungere 250 μl di tampone bloccante per pozzetto con una pipetta da 1000 μl. Incubare per 3 ore a temperatura ambiente (RT) sull'agitatore.
- Durante il tempo di incubazione, diluire gli anticorpi primari in tampone anticorpale in una provetta di reazione. Utilizzare 250 μl di tampone anticorpale per pozzetto e aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (vedere la Tabella 2) pipettandola direttamente nella soluzione utilizzando una pipetta da 2 μl. Mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Vortice poco dopo per garantire una corretta miscelazione.
nota: Per determinare la fluorescenza di fondo, la colorazione deve essere eseguita anche senza l'aggiunta dell'anticorpo primario. Per questo, incubare la fetta in soluzione anticorpale senza anticorpi primari secondo il protocollo.
- Trascorso il tempo di incubazione, rimuovere il tampone bloccante con una pipetta di plastica e aggiungere 250 μl di soluzione anticorpale contenente anticorpi primari per pozzetto. Incubare le fette con l'anticorpo primario per una notte a 4 °C su un agitatore.
- Il giorno successivo, lavare le fette con il tampone di lavaggio 1 3 volte per 10 minuti a RT su uno shaker.
- Rimuovere il terreno con una pipetta di plastica e aggiungere 300 μl di tampone di lavaggio 1 per pozzetto. Incubare a RT per 10 min. Ripeti 3 volte.
- Durante le fasi di lavaggio, diluire gli anticorpi secondari accoppiati a fluorofori nel tampone anticorpale in una provetta di reazione. Utilizzare 250 μl di tampone anticorpale per pozzetto e aggiungere la quantità appropriata di anticorpo (vedere la Tabella 2) pipettandola direttamente nella soluzione utilizzando una pipetta da 2 μl. Mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù più volte. Vortice poco dopo per garantire una corretta miscelazione.
cautela: Poiché gli anticorpi sono sensibili alla luce, tutti i passaggi da questo momento in poi devono essere eseguiti al buio.
- Dopo le fasi di lavaggio, rimuovere il tampone di lavaggio con una pipetta di plastica e aggiungere 250 μl di soluzione anticorpale contenente anticorpi secondari per pozzetto. Incubare le fette con anticorpi secondari per 90 minuti a RT al buio.
- Lavare le fette con il tampone di lavaggio 2 3 volte per 10 minuti a RT.
- Durante le fasi di lavaggio, diluire il 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in 0,1 M PB in una concentrazione di 1:2000.
- Rimuovere il tampone di lavaggio 2 con una pipetta di plastica e aggiungere 250 μl di soluzione DAPI per pozzetto. Incubare per 5 minuti a RT sull'agitatore.
- Rimuovere la soluzione DAPI con una pipetta di plastica e aggiungere 500 μl di 0,1 M PB per pozzetto con una pipetta da 1000 μl.
- Montare le fette sui vetrini del microscopio.
- Posizionare un vetrino da microscopio sotto lo stereoscopio. Con un pennello sottile, aggiungere tre gocce separate di 0,1 M PB sul vetrino. Posizionare una fetta per goccia sul vetrino del microscopio.
- Utilizzare il pennello fine per appiattire e orientare le fette sul vetrino del microscopio.
- Quando tutte le fette sono posizionate correttamente, rimuovere il PB in eccesso con un fazzoletto e asciugare accuratamente il vetrino.
cautela: Evita di asciugare completamente le fette di cervello.
- Aggiungere 80 μl di terreno di inclusione sul vetrino. Abbassare con cautela il vetrino coprioggetti sul vetrino, incorporando così le fette di cervello.
- Lasciare asciugare i vetrini nella cappa aspirante per 1-2 ore (coprirli per evitare l'esposizione alla luce) e conservarli in una scatola per vetrini da microscopio a 4 °C.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. Imaging
- Dopo che il mezzo di inclusione è completamente indurito, posizionare il vetrino del microscopio sotto il microscopio confocale.
nota: La microscopia a epifluorescenza combinata con il software di deconvoluzione dovrebbe produrre una qualità dell'immagine simile.
- Regolare le impostazioni del laser aumentando o diminuendo l'intensità del laser per ogni canale in modo che pochi pixel siano sovraesposti per garantire la massima distribuzione dei valori di grigio.
- Acquisisci tessuti virtuali dell'intera fetta di cervello per i diversi canali.
- Nel software di imaging, selezionare l'opzione Riquadri e delineare manualmente la fetta di cervello con l'impostazione della regione Riquadro.
- Distribuisci i punti di supporto in tutta la regione delle tessere e regola la messa a fuoco per i diversi punti di supporto premendo Verifica regioni/posizioni delle tessere....
- Regolare le impostazioni in modalità di acquisizione in base alla risoluzione desiderata e alle dimensioni del file dell'immagine risultante e avviare la scansione.
- Al termine della scansione, utilizzare la funzione Stitching per elaborare il tessuto virtuale. Esporta il file come .tif con la funzione Esportazione immagini.
3. Analisi basata su computer
- Carica tutti i singoli canali per un'immagine in FIJI facendo clic su File| Apri.
- Con lo strumento di selezione a mano libera, delineare un emisfero nel canale DAPI. Creare una maschera della selezione facendo clic su Modifica| Selezione| Crea maschera.
- Determinare l'intensità media della fluorescenza per i singoli canali (Mover e sinaptofisina) facendo clic su Analizza| Misura.
nota: Assicurati di selezionare i diversi canali per determinare i valori medi di intensità della fluorescenza per ciascun canale.
- Copia l'intensità media della fluorescenza per i singoli canali in un foglio di calcolo.
- Determinare l'intensità media di fluorescenza per i singoli canali in un'area di interesse delineando l'area anche con lo strumento di selezione a mano libera. Usa un atlante del cervello del topo come riferimento.
- Ripetere i passaggi 3.1-3.5 per tutti gli emisferi e tutte le aree di interesse.
nota: Determinare i valori per ciascun emisfero separatamente per confrontare successivamente i valori in un'area di interesse con quelli nell'emisfero (vedere il passaggio 4.2).
4. Gestione dei dati
- Nel caso in cui la fluorescenza di fondo sia elevata, potrebbe essere necessaria una sottrazione di fondo. Per questo, determinare l'intensità media della fluorescenza per la fetta processata senza anticorpi primari contro la proteina di riferimento (qui: sinaptofisina) e sottrarre tale valore da tutti i valori ottenuti per le regioni e gli emisferi del cervello.
- Quando sono state determinate le intensità medie di fluorescenza per i singoli canali per ogni emisfero e ogni area di interesse (vedi Tabella 3), calcolare il rapporto tra Mover e sinaptofisina dividendo il valore di Mover per il valore di sinaptofisina (giallo nella Tabella 3). Esegui questa azione per ogni emisfero e ogni area di interesse separatamente.
- Dividere il rapporto ottenuto per un'area di interesse per il rapporto ottenuto per l'emisfero corrispondente (arancione nella Tabella 3) per determinare il rapporto tra l'area di interesse e l'emisfero.
- Per determinare l'abbondanza relativa del Mover, tradurre il rapporto ottenuto in 4.2 in una percentuale determinando la sua deviazione da 1 (rosso nella Tabella 3). Un rapporto di 1,25 darebbe quindi un'abbondanza relativa del Mover del 25% superiore alla media, e un rapporto di 0,75 produrrebbe un'abbondanza relativa del Mover del 25% al di sotto della media.
Tabella 1: Soluzioni utilizzate in questo protocollo.
| Fissativo (500mL) |
Mix 20g di paraformaldeide (conc. totale: 4%)
50 mL 10x PBS soluzione madre (conc. totale: 1x)
450 mL bidest H2OAnsegue il pH a 7,4 con NaOH
Nota: Per risolvere la paraformaldeide nella PBS, riscaldare la soluzione. Non riscaldare oltre i 70 oC, poiché il PFA si disintegra a temperature superiori a 70 oC.
Attenzione: il PFA è tossico, potenzialmente cancerogeno e teratogeno. Indossare i guanti quando si lavora con PFA e lavorare sotto la cappa aspirante. Evitare l'ingestione. |
| 0.1M PB (1L) |
Soluzione madre X
35,61 g Na2HPO4,2H 2O in 1 L bidest H2O | Soluzione madre Y
27,60 g NaH2PO4,2H 2O in 1 L bidest H2O |
Mix 385 mL soluzione madre X
115 mL di soluzione madre Y
500 mL bidest H2O |
| Tampone bloccante (50 mL) |
Mescola 1.25 ml di siero di capra normale (conc. totale: 2.5%)
1,25 mL di siero d'asino normale (conc. totale: 2,5%)
0,5 mL di tensioattivo non ionico (Triton-X100, conc. totale: 1%)
47 mL 0,1 M PB |
| Tampone anticorpale (50 mL) |
Mescola 0.25 ml di siero normale di capra (conc. totale: 0.5%)
0,25 mL di siero d'asino normale (conc. totale: 0,5%)
0,1 mL di tensioattivo non ionico (conc. totale: 0,2%)
49,4 mL 0,1 M PB |
| Tampone di lavaggio 1 (50 mL) |
Mescola 1 ml di siero normale di capra (conc. totale: 2 %)
49 mL 0,1 M PB |
| Tampone di lavaggio 2 (50 mL) |
Mix 0.5 mL di siero normale di capra (conc. totale: 1 %)
49,5 mL 0,1 M PB |
Tabella 2: Anticorpi utilizzati in questo protocollo.
| Anticorpi primari |
| Diretto contro | Specie ospiti | RRID | concentrazione |
| motore | coniglio | AB_10804285 | s1:1000 |
| Sinaptofisina | cavia | AB_1210382 | s1:1000 |
| Anticorpi secondari |
| Specie target | Specie ospiti | Fluoroforo | concentrazione |
| coniglio | asino | AlexaFluor 647 | s1:1000 |
| cavia | capra | AlexaFluor 488 | s1:1000 |
Tabella 3: Esempio di trattamento dei dati.
| Emisfero |
| Emisfero # | Intensità media di fluorescenza Sinaptofisina (U.A.) | Intensità media di fluorescenza Mover (A.U.) | Rapporto Mover/Sinaptofisina | | |
1
2
3
4
5
6 | 29.134
31.008
38.641
30.775
21.658
27.277 | 22.810
24.046
29.324
25.444
18.091
23.364 | =C3/B3 0,783
=C4/B4 0,775
=C5/B5 0,759
=C6/B6 0,827
=C7/B7 0,835
=C8/B8 0,857 | | |
| Ippocampo |
| Emisfero # | Intensità media di fluorescenza Sinaptofisina (U.A.) | Intensità media di fluorescenza Mover (A.U.) | Rapporto Mover/Sinaptofisina | Rapporto con emisfero | Abbondanza relativa del motore (%) |
1
2
3
4
5
6 | 35.26
33.955
41.231
39.853
30.129
28.737 | 29.889
27.825
31.978
31.787
27.817
25.861 | =C11/B11 0,848
=C12/B12 0,819
=C13/B13 0,776
=C14/B14 0,798
=C15/B15 0,923
=C16/B16 0,900 | =D11/D3 1,083
=D12/D4 1,057
=D13/D5 1,022
=D14/D6 0,965
=D15/D7 1,105
=D16/D8 1,051 | =(E11-1)*100 8.269
=(E12-1)*100 5.673
=(E13-1)*100 2.200
=(E14-1)*100 -3.528
=(E15-1)*100 10.530
=(E16-1)*100 5.064 |
