Valutazione dell'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari muscolari longitudinali dorsali in Drosophila

1. Congelamento rapido e bisezione del torace

1. Prima di iniziare le bisezioni, riempire un pallone Dewar con azoto liquido indossando guanti crioprotettivi e occhiali di sicurezza adeguati. Ottieni un rompilame, lame di piume, un paio di pinze sottili, ghiaccio, 1x PBS ghiacciato e pinzette criogeniche.
2. Prepara un secchiello per il ghiaccio per mantenere 1x PBS ghiacciato.
3. Usa il rompilama per afferrare la lama della piuma ad angolo e piega la lama per rompere un piccolo pezzo. Il rompilama può quindi bloccare la lama in posizione per l'uso come un piccolo bisturi.
   nota: Una lama dovrebbe durare per tutti i gruppi. Cambia se la lama si rompe o diventa smussata.
4. Aggiungere un puntale per pipetta pulito al P200 e rimuovere 1/5 del puntale per il trasporto dei campioni.
5. Preparare una nuova provetta per microcentrifuga per ogni gruppo e aggiungere 200 μl di 1x PBS a ciascuna provetta. Questa seconda provetta verrà utilizzata per raccogliere le preparazioni DLM finali.
6. Rimuovere tutto il PBS 1x dalle provette utilizzando una pipetta Pasteur.
7. Indossando un adeguato dispositivo di protezione, immergere il tubo nel pallone di azoto liquido per 10 s con le pinzette criogeniche.
   nota: I tubi devono essere chiusi ermeticamente per evitare che il tubo esploda.
8. Rimuovere la provetta dall'azoto liquido e aggiungere circa 300 μL di 1x PBS ghiacciato ai campioni con una pipetta Pasteur. Mantieni i campioni sul ghiaccio.
9. Aggiungere 1x PBS ghiacciato alla capsula di dissezione da 10 cm rivestita con elastomero siliconico ed erogare il primo torace con la pipetta modificata da 200 μl.
10. Posiziona il torace con il lato ventrale rivolto verso l'alto. In una mano usa un paio di pinze smussate per posizionare il torace e nell'altra usa un paio di pinze sottili per rimuovere parte del ganglio toracico per esporre la linea mediana del torace.
11. Usa la linea mediana del torace come guida per eseguire un taglio poco profondo attraverso 1/3 del torace con la lama.
12. Rimuovere la lama dal torace e posizionare il torace a un angolo di 45° con la pinza smussata. Reinserire la lama e tagliare dritto lungo la linea mediana del torace. Ciò risulterà in due emitorace.
13. Prendi un emitorace alla volta e rimuovi il tessuto in eccesso sotto la fibra muscolare DLM F (Figura 1B), la fibra più ventrale. Utilizzare la lama per eseguire con cura uno o due tagli per rimuovere il tessuto in eccesso senza danneggiare i DLM.
14. Una volta isolato, trasferire l'emitorace nella provetta corretta con 1x PBS.
15. Ripetere i passaggi 1.6-14 fino a quando non vengono realizzati 10 emitrorace sezionati per gruppo.

2. Colorazione strutturale

1. Dopo aver diviso in due i campioni del torace, posizionare il tessuto in un tampone bloccante (1x PBS con 0,1% di siero di capra normale e 0,2% di Triton X-100 a pH 7,4) per permeabilizzare il tessuto e prevenire la colorazione non specifica. Utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere l'eccesso di 1x PBS e aggiungere 1,5 mL di tampone bloccante a ciascuna provetta. Bloccare i tessuti per almeno 1 ora a 4 °C.
2. Preparare i campioni per la colorazione strutturale utilizzando un anticorpo coniugato fluorescente, la perossidasi di rafano 488 (anti-HRP-488) alla diluizione di 1:200 e la falloidina-647 alla diluizione di 1:1000 in tampone bloccante per colorare rispettivamente i motoneuroni e il tessuto muscolare. Produrre abbastanza colorante per avere 150 μl per provetta. Conservare la macchia a 4 °C coperta con un foglio di alluminio o in una scatola scura fino al momento della colorazione.
3. Dopo il blocco, rimuovere il tampone di blocco in eccesso con una pipetta di vetro Pasteur.
4. Prima di erogare la macchia strutturale, agitare la macchia. Aggiungere 150 μl di colorante in ciascuna provetta. Posizionare i campioni in una scatola scura sul rotatore a temperatura ambiente per 2 ore.
5. Rimuovere la macchia e lavare i fazzoletti quattro volte in 1,5 ml di temperatura ambiente 1x PBS con Triton X-100 allo 0,3% per 5 minuti sul rotatore in una scatola scura. I campioni sono ora pronti per essere montati su un vetrino.

3. Montaggio del tessuto

1. Dopo aver lavato i campioni in PBST, preparare un vetrino da microscopio per montare il tessuto per la colorazione. Prepara materiali di consumo aggiuntivi, tra cui vetrini di copertura, una pipetta P200, puntali per pipette da 200 μl, forbici, rinforzi trasparenti, pinze a bordo dritto, supporti di montaggio fluorescenti anti-sbiadimento, smalto per unghie e una scatola scura per coprire i vetrini.
2. Etichettare il vetrino per identificare i campioni e pulirlo con salviette Kim per rimuovere eventuali macchie.
3. Per garantire che il vetrino coprioggetti non danneggi i campioni di emitorace, costruire un "ponte" utilizzando etichette di rinforzo. Tagliare a metà un'etichetta di rinforzo e posizionare ciascuna metà a circa 15 mm di distanza. Questa distanza deve essere inferiore alla larghezza del vetrino coprioggetto. Ripeti questo passaggio quattro volte per completare un "ponte" alto 5 etichette.
4. Prendere la pipetta P200 e modificare un puntale tagliando 1/5 del puntale per trasferire i campioni sul vetrino. I campioni devono essere trasferiti sul vetrino al centro del ponte.
5. Prendi il bordo di una salvietta da laboratorio e rimuovi l'eccesso di PBST. Usando una pinza, disporre i DLM in modo che tutti i campioni siano rivolti verso il muscolo verso l'alto e con la cuticola verso il basso.
6. Utilizzando un puntale per pipetta P200 standard, applicare 70 μl di terreno di montaggio sul vetrino, evitando la formazione di bolle d'aria. Erogare il supporto in uno schema circolare all'interno dei rinforzi partendo dall'esterno verso il centro.
7. Posizionare un vetrino coprioggetti sui rinforzi.
8. Usa lo smalto per rivestire i bordi esterni attorno al perimetro del vetrino. Applicare generosamente fino a formare una tenuta completa del tessuto.
9. Posizionare il vetrino su una superficie piana al buio, lasciando asciugare almeno 10 minuti e prevenire il fotosbiancamento o la perdita di fluorescenza. I vetrini possono ora essere utilizzati immediatamente per l'imaging o altrimenti conservati in una cartella di vetrini a -20 °C per una visualizzazione successiva.

Figura 1: Denervazione progressiva delle sinapsi DLM in un modello di SLA in Drosophila. (A) La generazione di mosche transgeniche della SLA che esprimono una forma mutante umana di proteina legante il catrame di 43 kDa (TDP-43) è mostrata nello schema. (B) L'illustrazione raffigura la forma e l'orientamento di un emitorace in una Drosophila adulta. Utilizzando il protocollo, possiamo osservare la progressiva perdita di integrità sinaptica delle sinapsi DLM NMJ attraverso la colorazione strutturale dei motoneuroni con HRP (verde) e del tessuto muscolare con falloidina (magenta). Il nostro modello descrive la perdita di integrità sinaptica in un modello adulto di SLA attraverso la generazione di mosche adulte che esprimono un mutante da TDP-43M337V umano nei motoneuroni (Figura 1F\u2012H) rispetto alle mosche WT (Figura 1C\u2012E) nella fibra muscolare C. Le frecce evidenziano esempi di una sinapsi WT (Figura 1C) e un esempio di perdita di integrità sinaptica. Barra di scala =20 μm con ingrandimento 63x.