Valutazione dell'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari muscolari longitudinali dorsali in Drosophila

Abstract

Fonte: Sidisky, J. M., et al. Visualizzazione della degenerazione sinaptica nella Drosophila adulta in associazione con la neurodegenerazione. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video dimostra un protocollo per valutare l'integrità strutturale delle giunzioni neuromuscolari nei muscoli longitudinali dorsali di Drosophila. La procedura prevede la colorazione di neuroni e muscoli con due anticorpi distinti e il confronto dei modelli di fluorescenza tra mosche mutanti e wild-type. Una riduzione della colorazione neuronale nei moscerini mutanti indica neurodegenerazione, mentre la struttura muscolare rimane intatta.

Protocollo

1. Congelamento rapido e bisezione del torace

1. Prima di iniziare le bisezioni, riempire un pallone Dewar con azoto liquido indossando guanti crioprotettivi e occhiali di sicurezza adeguati. Ottieni un rompilame, lame di piume, un paio di pinze sottili, ghiaccio, 1x PBS ghiacciato e pinzette criogeniche.
2. Prepara un secchiello per il ghiaccio per mantenere 1x PBS ghiacciato.
3. Usa il rompilama per afferrare la lama della piuma ad angolo e piega la lama per rompere un piccolo pezzo. Il rompilama può quindi bloccare la lama in posizione per l'uso come un piccolo bisturi.
   nota: Una lama dovrebbe durare per tutti i gruppi. Cambia se la lama si rompe o diventa smussata.
4. Aggiungere un puntale per pipetta pulito al P200 e rimuovere 1/5 del puntale per il trasporto dei campioni.
5. Preparare una nuova provetta per microcentrifuga per ogni gruppo e aggiungere 200 μl di 1x PBS a ciascuna provetta. Questa seconda provetta verrà utilizzata per raccogliere le preparazioni DLM finali.
6. Rimuovere tutto il PBS 1x dalle provette utilizzando una pipetta Pasteur.
7. Indossando un adeguato dispositivo di protezione, immergere il tubo nel pallone di azoto liquido per 10 s con le pinzette criogeniche.
   nota: I tubi devono essere chiusi ermeticamente per evitare che il tubo esploda.
8. Rimuovere la provetta dall'azoto liquido e aggiungere circa 300 μL di 1x PBS ghiacciato ai campioni con una pipetta Pasteur. Mantieni i campioni sul ghiaccio.
9. Aggiungere 1x PBS ghiacciato alla capsula di dissezione da 10 cm rivestita con elastomero siliconico ed erogare il primo torace con la pipetta modificata da 200 μl.
10. Posiziona il torace con il lato ventrale rivolto verso l'alto. In una mano usa un paio di pinze smussate per posizionare il torace e nell'altra usa un paio di pinze sottili per rimuovere parte del ganglio toracico per esporre la linea mediana del torace.
11. Usa la linea mediana del torace come guida per eseguire un taglio poco profondo attraverso 1/3 del torace con la lama.
12. Rimuovere la lama dal torace e posizionare il torace a un angolo di 45° con la pinza smussata. Reinserire la lama e tagliare dritto lungo la linea mediana del torace. Ciò risulterà in due emitorace.
13. Prendi un emitorace alla volta e rimuovi il tessuto in eccesso sotto la fibra muscolare DLM F (Figura 1B), la fibra più ventrale. Utilizzare la lama per eseguire con cura uno o due tagli per rimuovere il tessuto in eccesso senza danneggiare i DLM.
14. Una volta isolato, trasferire l'emitorace nella provetta corretta con 1x PBS.
15. Ripetere i passaggi 1.6-14 fino a quando non vengono realizzati 10 emitrorace sezionati per gruppo.

2. Colorazione strutturale

1. Dopo aver diviso in due i campioni del torace, posizionare il tessuto in un tampone bloccante (1x PBS con 0,1% di siero di capra normale e 0,2% di Triton X-100 a pH 7,4) per permeabilizzare il tessuto e prevenire la colorazione non specifica. Utilizzare una pipetta Pasteur per rimuovere l'eccesso di 1x PBS e aggiungere 1,5 mL di tampone bloccante a ciascuna provetta. Bloccare i tessuti per almeno 1 ora a 4 °C.
2. Preparare i campioni per la colorazione strutturale utilizzando un anticorpo coniugato fluorescente, la perossidasi di rafano 488 (anti-HRP-488) alla diluizione di 1:200 e la falloidina-647 alla diluizione di 1:1000 in tampone bloccante per colorare rispettivamente i motoneuroni e il tessuto muscolare. Produrre abbastanza colorante per avere 150 μl per provetta. Conservare la macchia a 4 °C coperta con un foglio di alluminio o in una scatola scura fino al momento della colorazione.
3. Dopo il blocco, rimuovere il tampone di blocco in eccesso con una pipetta di vetro Pasteur.
4. Prima di erogare la macchia strutturale, agitare la macchia. Aggiungere 150 μl di colorante in ciascuna provetta. Posizionare i campioni in una scatola scura sul rotatore a temperatura ambiente per 2 ore.
5. Rimuovere la macchia e lavare i fazzoletti quattro volte in 1,5 ml di temperatura ambiente 1x PBS con Triton X-100 allo 0,3% per 5 minuti sul rotatore in una scatola scura. I campioni sono ora pronti per essere montati su un vetrino.

3. Montaggio del tessuto

1. Dopo aver lavato i campioni in PBST, preparare un vetrino da microscopio per montare il tessuto per la colorazione. Prepara materiali di consumo aggiuntivi, tra cui vetrini di copertura, una pipetta P200, puntali per pipette da 200 μl, forbici, rinforzi trasparenti, pinze a bordo dritto, supporti di montaggio fluorescenti anti-sbiadimento, smalto per unghie e una scatola scura per coprire i vetrini.
2. Etichettare il vetrino per identificare i campioni e pulirlo con salviette Kim per rimuovere eventuali macchie.
3. Per garantire che il vetrino coprioggetti non danneggi i campioni di emitorace, costruire un "ponte" utilizzando etichette di rinforzo. Tagliare a metà un'etichetta di rinforzo e posizionare ciascuna metà a circa 15 mm di distanza. Questa distanza deve essere inferiore alla larghezza del vetrino coprioggetto. Ripeti questo passaggio quattro volte per completare un "ponte" alto 5 etichette.
4. Prendere la pipetta P200 e modificare un puntale tagliando 1/5 del puntale per trasferire i campioni sul vetrino. I campioni devono essere trasferiti sul vetrino al centro del ponte.
5. Prendi il bordo di una salvietta da laboratorio e rimuovi l'eccesso di PBST. Usando una pinza, disporre i DLM in modo che tutti i campioni siano rivolti verso il muscolo verso l'alto e con la cuticola verso il basso.
6. Utilizzando un puntale per pipetta P200 standard, applicare 70 μl di terreno di montaggio sul vetrino, evitando la formazione di bolle d'aria. Erogare il supporto in uno schema circolare all'interno dei rinforzi partendo dall'esterno verso il centro.
7. Posizionare un vetrino coprioggetti sui rinforzi.
8. Usa lo smalto per rivestire i bordi esterni attorno al perimetro del vetrino. Applicare generosamente fino a formare una tenuta completa del tessuto.
9. Posizionare il vetrino su una superficie piana al buio, lasciando asciugare almeno 10 minuti e prevenire il fotosbiancamento o la perdita di fluorescenza. I vetrini possono ora essere utilizzati immediatamente per l'imaging o altrimenti conservati in una cartella di vetrini a -20 °C per una visualizzazione successiva.

Risultati

Figura 1: Denervazione progressiva delle sinapsi DLM in un modello di SLA in Drosophila. (A) La generazione di mosche transgeniche della SLA che esprimono una forma mutante umana di proteina legante il catrame di 43 kDa (TDP-43) è mostrata nello schema. (B) L'illustrazione raffigura la forma e l'orientamento di un emitorace in una Drosophila adulta....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
32% Formaldeide	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 15714	Conservazione dei tessuti
PancaRocker	Genesee Scientifico	31-302	Rotazione dei campioni durante la colorazione
Lama Spaccalama	Strumenti per la scienza	Codice 10053-09	Utilizzato per tenere la lama della piuma
vetrini coprioggetti	Fisher Scientifico	Codice 12548A	Per il montaggio di tessuti
guanti criogenici	VWR	97008-198	Proteggere le mani dall'azoto liquido
pinzette criogeniche	VWR	82027-432	Tenere la provetta da 2,0 mL in azoto liquido
pallone dewar-1900 ml	Thomas Scientific	Codice: 5028M54	Trattenere l'azoto liquido
Lame di piume	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 72002-01	Lame per bisturi
Forecps fini x 2	Strumenti per la scienza	Codice 11252-20	Un paio fine per la pulizia della linea mediana del torace. L'altro paio può essere smussato usando una pietra per affilare.
anti HRP coniugato FITC	Laboratori Jackson	Codice 123-545-021	Colora i motoneuroni. Utilizzato a concentrazione 1:100
scatola congelatore (nero)	Fisher Scientifico	14100F	Protegge i campioni dalla luce
pipette in vetro pasteur	VWR	Codice 14637-010	Utilizzato per trasferire i campioni
vetrini	Fisher Scientifico	12550143	Per il montaggio di tessuti
Supporti di montaggio (Vectashield) anti-sbiadimento	VWR	Codice 101098-042	I supporti di montaggio mantengono la segnalazione fluorescente
smalto per unghie	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 72180	Guarnizioni vetrini per microscopio
siero di capra normale	Fisher Scientifico	PCN5000	Previene il legame non specifico degli anticorpi
Pennello	Genesee Scientifico	59-204	Trasferimento di mosche
Pbs	Fisher Scientifico	10-010-023	Soluzione salina per dissezione e colorazione
Falloidina 647	Abcam	AB176759	Colora la F-actina nel tessuto muscolare. Utilizzato a concentrazione 1:1000
Piastra di Petri in plastica (100 mm)	VWR	Codice 25373-100	Piatto di dissezione
etichette di rinforzo	W.B. Mason	AVE05722	Fornisce supporto per il vetrino coprioggetto sul tessuto montato
blocco di affilatura	Grainger	1RDF5	Mantenere affilate le pinze fini e anche smussare la coppia separata
cartella delle diapositive	VWR	Codice 10126-326	Conservazione dei campioni
Forbici da ufficio standard	W.B. Mason	ACM40618	Taglio di etichette di rinforzo
Sylgard 184	Scienze della microscopia elettronica	Codice 24236-10	Rivestimento per piatto di dissezione
Tritone-X-100	Scienze della microscopia elettronica	Codice 22140	Aiuta a permeabilizzare i tessuti
Sissors di dissezione di Vannas	Strumenti per la scienza	1500-00	Utilizzato per la rimozione delle zampe di mosca e l'incisione sul torace