Indagine su una lesione cerebrale larvale di pesce zebra utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a scansione su larga scala

Abstract

Fonte: Kuipers, J. et al., Microscopia elettronica a trasmissione a scansione su larga scala (nanotomia) del cervello sano e ferito di pesce zebra.J. Vis. Exp. (2016).

Questo video mostra un metodo per studiare la lesione cerebrale larvale del pesce zebra utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione a scansione su larga scala (STEM), una tecnica che combina elementi di microscopia elettronica a scansione (SEM) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per produrre immagini ad alta risoluzione. Descrive le fasi coinvolte nella preparazione dei campioni e nell'acquisizione di immagini STEM ad alta risoluzione per identificare le lesioni cerebrali.

Protocollo

1. Preparazione del campione

1. Fissazione e inclusione
   1. fissazione
      1. Anestetizzare le larve di pesce in tricaina (0,003%) aggiunta all'acqua di pesce zebra E3 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO_4, 10 mM HEPES, pH 7,6) e testare la profondità dell'anestesia colpendo delicatamente con una punta di pipetta da 200 μl al microscopio di dissezione fino a quando non viene più rilevato alcun movimento (Figura 1A).
      2. Quando si elaborano i campioni per la microscopia elettronica correlativa (EM) dopo aver acquisito i dati di imaging in vivo utilizzando l'imaging confocale o a 2 fotoni in agarosio all'1,8% come descritto, fissare le larve nell'agarosio utilizzando paraformaldeide (PFA) al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) contenente Triton-X-100 (0,05%).
      3. Tagliare le larve dall'agarosio e lavorarle per l'EM su larga scala.
      4. Fissare le larve in paraformaldeide fresca al 4% in PBS contenente Triton-X-100 (0,05%) per 2 ore a temperatura ambiente in tubi di plastica.
         nota: Le cellule coltivate in coltura (in vitro) possono essere fissate direttamente nella glutaraldeide, come descritto nella fase successiva (1.1.1.5).
      5. Rimuovere la soluzione e aggiungere 100 μl di PFA allo 0,5%, glutaraldeide (GA) al 2% e cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4). Conservare per una notte a 4 °C. Sciacquare due volte i campioni con cacodilato di sodio 0,1 M.
      6. Tagliare le teste larvali rostralmente al rombencefalo per facilitare la penetrazione dell'osmio. Utilizzare siringhe/pinze sottili.
      7. Larve Postfix in tetrossido di osmio all'1% (OsO₄)/ferrocianuro di potassio all'1,5% (K₄[Fe(CN)₆]) in cacodilato di sodio 0,1 M su ghiaccio per 2 ore e risciacquo 3 x 5 min in H₂O a doppia distillazione.
      8. Disidratare in etanolo mediante incubazioni di 20 minuti in concentrazioni crescenti di etanolo (50%, 70%, 3 volte 100%).
   2. Incorporamento
      1. Preparare la resina epossidica secondo le ricette standard utilizzate nei laboratori EM.
         nota: Utilizziamo la resina epossidica come segue: mescolando 19,8 g di etere glicidico 100, 9,6 g di anidride di acido 2-dodecenilsuccinico e 11,4 g di anidride metilnadica utilizzando un agitatore magnetico. Aggiungere 0,5 g di DMP-30 (tris-(dimetilamminometil)fenolo) e mescolare ancora.
      2. Incubare le larve per una notte in resina epossidica al 50% in etanolo (v/v) durante la rotazione (RT).
      3. Sostituire la resina epossidica diluita con resina pura. Incubare per 30 minuti, aggiungere nuovamente resina fresca e incubare per altri 30 minuti. Anche in questo caso, rinfrescare la resina e incubare 3 ore a RT, seguite da 15 minuti a 58 °C e un'altra 1 ora a RT a bassa pressione (200 mbar).
      4. Orientare le teste in stampi da inclusione piatti in silicone disponibili in commercio al microscopio da dissezione utilizzando un ago o uno stuzzicadenti con la parte anteriore rivolta verso il lato dello stampo o secondo necessità (Figura 1B).
      5. Polimerizzare la resina epossidica per una notte a 58 °C. Se la resina epossidica è ancora troppo morbida, lasciare che polimerizzi e si indurisca un altro giorno a 58 °C. Testare la rigidità applicando pressione con una pinza. Se questo lascia facilmente una rientranza, lasciare un altro giorno per polimerizzare e indurire a 58 °C. Quando il campione è completamente indurito, procedere alla rifilatura e al sezionamento.
      6. Taglia via la resina in eccesso dal mozzicone usando le lamette da barba (Figura 1B).
2. Sezionamento, contrasto e montaggio
   1. Taglio
      1. Blocco di resina epossidica a sezione utilizzando un ultramicrotomo.
      2. Utilizzare un coltello da vetro o un coltello a pianta di diamante per tagliare sezioni semisottili (500 nm) per la colorazione blu toluidina/fucsina basica (Figura 1D) per rilevare il corretto posizionamento.
      3. Trasferire sezioni semisottili su vetrini microscopici prelevandole con una pipetta di vetro Pasteur la cui punta è stata chiusa sciogliendola in una fiamma. Asciugare su una piastra calda fino a quando non rimane acqua. Colorare per 10 secondi con blu di toluidina all'1% in acqua su una piastra calda e, dopo aver risciacquato con acqua, colorare per 10 secondi con fucsina basica allo 0,05% in tetraborato di sodio all'1%. Esaminare con un normale microscopio ottico da 10X a 40X.
      4. Quando viene raggiunto il sito/orientamento corretto all'interno del cervello, continuare a sezionare il blocco di resina epossidica con un coltello diamantato per tagliare sezioni ultrasottili (~ 70 nm; Figura 1E)
      5. Utilizzare strutture anatomiche facilmente identificabili all'interno e intorno al cervello, comprese le fosse olfattive, gli occhi e i confini della materia grigio-bianca, per identificare la regione di interesse durante il sezionamento ultrasottile e per regolare l'angolo di sezionamento quando il campione è inclinato.
      6. Montare la sezione su griglie in rame L2 x 1 a fessura singola (Figura 1F), per consentire l'acquisizione senza interruzioni da barre di griglia. Utilizzare le griglie rivestite Formvar per sostenere le sezioni.
   2. contrastante
      1. Colorare le sezioni ultrasottili su griglie per 2 minuti in acetato di uranile al 2% in metanolo seguito da citrato di piombo Reynolds per altri 2 minuti.

2. Acquisizione di immagini

1. Microscopia elettronica a trasmissione a scansione su larga scala (STEM)
   nota: Utilizziamo la scansione EM con un generatore di scansioni esterno in grado di acquisire più ampi campi visivi ad alta risoluzione utilizzando il rilevamento STEM. In genere, un'immagine generata in questo modo equivale ai campi visivi di ~ 100 immagini al microscopio elettronico a trasmissione (TEM), riducendo significativamente la quantità di stitching.
   1. Montaggio del campione nel microscopio
      1. Posizionare la griglia con la sezione nel portacampioni a griglia multipla e trasferirla nella camera del SEM.
   2. Allineamento del rivelatore STEM
      1. Posizionare la griglia con il campione sotto il raggio e spostarla verso l'alto in modo che si trovi a circa 5 mm dall'asta della lente. Acquisire un'immagine a 20 kV utilizzando il rivelatore integrato nell'obiettivo.
      2. Concentrati sul bordo della griglia e regola la distanza di lavoro a 4,0 mm.
      3. Spostare il supporto del campione in una posizione sicura e portare il rilevatore STEM.
      4. Centrare il foro del rivelatore STEM nel campo dell'immagine ruotando le viti di regolazione mentre si riprende l'immagine alla massima velocità con il rivelatore nell'obiettivo.
      5. Riportare con cautela il supporto del campione che si inserirà appena tra l'asta della lente e il rivelatore.
      6. Acquisire un'immagine con il rilevatore integrato nell'obiettivo per assicurarsi che si trovi sull'area della sezione.
      7. Passa al rilevamento STEM (guadagno medio e tutti i quadranti impostati su "meno"), acquisisci un'immagine e seleziona l'area da scansionare.
      8. Aumentare la tensione di accelerazione a 21 kV e attendere la stabilizzazione del fascio (immagine di nuovo stabile), quindi passare a 29 kV con incrementi di 2 kV.
   3. Acquisizione di immagini
      1. Pre-irradiare il campione (per evitare variazioni di luminosità causate dall'e-beam) rimpicciolendolo in modo che l'intera area da scansionare si adatti alla finestra dell'immagine.
      2. Modificare l'apertura a 120 μm (per mantenere la corretta gamma dinamica, i guadagni del rivelatore devono essere ridotti di un passo).
      3. Sfocare l'immagine in modo da risultare sfocata.
      4. Rendi l'area scansionata il più stretta possibile utilizzando l'opzione di scansione dell'area ridotta.
      5. Impostare la velocità di scansione in modo che un fotogramma venga scansionato in circa 1 - 2 sec.
         nota: A seconda delle dimensioni e del tessuto, questa operazione richiede in genere da 1/2 ora (campo visivo (FOV) di 100 x 100 μm) fino a 3 ore (1.000 x 500 μm).
      6. Ingrandisci almeno 100X e scansiona una piccola area per 10 sec.
         nota: Quando quest'area non cambia luminosità rispetto all'ambiente circostante, è sufficiente la pre-irradiazione.
      7. Ripristino dell'apertura di 30 μm (e guadagno STEM sul medio)
      8. Concentrati sul campione.
      9. Allineare l'apertura utilizzando il wobbler (con ingrandimento ~ 40.000X).
      10. Durante la messa a fuoco, selezionare l'area/la funzione più chiara e impostare la velocità di scansione in modo che i dettagli siano visibili.
      11. Nel software del microscopio, regolare la luminosità e il contrasto osservando attentamente l'istogramma per mantenere tutti i pixel nella gamma dinamica. Fai lo stesso per l'area/le caratteristiche più scure.
      12. Torna all'area luminosa e controlla di nuovo. Stai al sicuro in modo che ci sia un po' di spazio su entrambi i lati dell'istogramma.
      13. Rimpicciolisci in modo che l'intera area da scansionare si adatti alla finestra di imaging e avvia il programma di acquisizione di grandi aree.
      14. Utilizzare l'opzione della procedura guidata per impostare un mosaico selezionando un'area dallo schermo. Utilizzare la dimensione dei pixel da 2 a 5 nm a seconda dei dettagli necessari. Utilizzare il tempo di permanenza di 3 μs per STEM.
      15. Selezionare l'opzione "autofocus sul riquadro precedente", utilizzare il software di acquisizione su larga scala autofocus con le impostazioni aziendali predefinite, selezionare la casella "verifica impostazione prima dell'esecuzione" e definire dove salvare i dati.
      16. Premere "ottimizza" per controllare le impostazioni del microscopio.
          nota: Ora, verrà mostrato il tempo necessario. Questo potrebbe essere fino a 72 ore per aree di 1 x 0,5 mm.
      17. Nella finestra, "risoluzione massima delle piastrelle" digita 20.000 in modo che le singole tessere non siano più grandi di 20k x 20k, evitando effetti di bordo smussato. Premi "esegui".
      18. Quando viene richiesto di controllare la messa a fuoco e la luminosità/contrasto (B/C), spegnere il generatore di scansione esterno e regolare attentamente la messa a fuoco e l'astigmatismo nel software del microscopio. Non modificare B/C.
          nota: Il tavolino può essere spostato e l'ingrandimento modificato, ma l'ingrandimento deve essere riportato alla dimensione in pixel desiderata.
      19. Riaccendere il generatore di scansione esterno e premere "Continua".

Risultati

Figura 1: Flusso di lavoro della microscopia elettronica tissutale su larga scala su cervelli di pesce zebra. (A)Larva di pesce zebra di 7 giorni. (B) Teste larvali di pesce zebra incastonate fianco a fianco in resina epossidica. (C) Coltello di vetro per il sezionamento semi-sottile e l'orientamento del campione. (D) Sezione rappresentativa semisot...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
prodotti chimici
Basso punto di fusione agarosio	VWR	Numero 444152G
tricaina	sigma	E10521
Tritone - X-100	sigma	X100
Glutaraldeide	Poliscienze	Anno 1909
Cacodilato di sodio	sigma	Codice: C0250
di osmiodi tetrossido	Scienze della microscopia elettronica	Codice: 19114
ferrocianuro di potassio (K4[Fe(CN)]6)	Merck	4984
etanolo	VWR	Codice 20821.365
uranile	Merck	Codice: 8473
di sodiotetraborato	Merck	1063808
Tolduidene blu	Merck	Anno 1273
Fucsina di base	BDH	340324
Citrato di piombo	BDH	Interrotto
EPON
Anidride acida 2-dodecenilsuccinica	Serva	Codice: 20755
metilnadica	Serva	Codice 29452
etere glicidico 100	Serva	Codice: 21045
DMP-30	Poliscienze	553
Stampo da incasso piatto standard	Scienze della microscopia elettronica	Codice 70901
coltello diamantato	Diatome Inc.
griglie in rame	Scienze della microscopia elettronica
nastro biadesivo in carbonio	Scienze della microscopia elettronica
Scansione EM Zeiss Supra55	Zeiss
ultramicrotomo Leica EM UC7	Leica
Generatore di scansione esterno Atlas	Fibics

acetato di anidride