Differenziazione e maturazione di cellule staminali embrionali umane in organoidi neurali

Abstract

Fonte: Cosset, E., et al. Organoidi neurali umani per lo studio del cancro al cervello e delle malattie neurodegenerative. J. Vis. Exp. (2019)

In questo video, viene dimostrato un protocollo graduale per le cellule staminali embrionali umane in organoidi neurali. Il metodo prevede l'induzione della formazione di rosette neuronali, seguita da una maturazione controllata e dalla coltura finale su una membrana idrofobica per ottenere organoidi neurali completamente sviluppati.

Protocollo

1. Mantenimento e coltura di cellule staminali embrionali umane indifferenziate (hESC)

1. Eseguire la manutenzione e l'espansione degli hSEC in condizioni di assenza di alimentatore pre-rivestendo le piastre con una matrice extracellulare specifica.
   1. Scongelare 300 μL di matrice extracellulare a 4 °C (intervallo di concentrazione tipico 18-22 mg/mL, tenere in ghiaccio) e mescolare delicatamente con 15 mL di terreno freddo DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) per evitare la gelificazione prematura della matrice extracellulare. Aggiungere 7,5 mL di matrice extracellulare a entrambi i matracci T150.
   2. Incubare le piastre rivestite con matrice extracellulare a 37 °C per almeno 1 ora (massimo tutta la notte).
   3. Rimuovere il terreno e seminare le hESC a una densità di 6,5 x 104 cellule/cm².
2. Mantenere H1 (linea cellulare hESC) nel terreno hESC e l'1% di penicillina/streptomicina.
3. Passare le celle con procedura enzimatica: aggiungere 7,5 mL di soluzione enzimatica a un pallone da 75 cm2 per un periodo di 1-2 minuti a 37 °C. Una volta che le cellule sono completamente staccate, aggiungere 7,5 mL di DMEM-F12, quindi centrifugare per 5 minuti a 300 x g. Per consentire una migliore sopravvivenza, ri-piastrare le cellule alla densità desiderata su piastre rivestite di matrice extracellulare, nello stesso terreno contenente l'inibitore della proteina chinasi associata a Rho (ROCK) (10 μM) per 24 ore.

2. organoidi neurali derivati da hESC

1. 24 ore prima di iniziare la coltura 3D, sostituire il terreno hESC con un terreno privo di siero integrato con un inibitore ROCK da 10 μM (entrambi i componenti sono necessari per supportare la sopravvivenza cellulare e la formazione spontanea della neurosfera durante la fase di aggregazione in una piastra a micropozzetti). Le celle dovrebbero essere al 60% di confluenza. Il giorno successivo (giorno 0), staccare le colonie di hESC come cellule singole: rimuovere il terreno, sciacquare con PBS senza Ca²⁺/Mg²⁺, aggiungere 5 mL di soluzione di dissoluzione enzimatica e incubare a 37 °C per 1-2 min.
2. Raccogliere le cellule in un terreno privo di siero integrato con 10 μM di inibitore ROCK e centrifugarle a 300 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e contare le cellule in 10 mL di terreno privo di siero integrato con 10 μM di inibitore ROCK.
3. Parallelamente, sciacquare la piastra per micropozzetti con 2 mL di terreno privo di siero per pozzetto e centrifugare la piastra a 1200 x g per 5 minuti per rimuovere tutte le bolle, che possono prevenire la formazione di neurosfere.
4. Preparare 28,2 x 10⁶ di cellule in 12,5 mL di terreno privo di siero integrato con 10 μM di inibitore ROCK. Erogare 1000 cellule/micropozzetto. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti e porre la piastra nell'incubatore a 37 °C per una notte (massimo 36 ore). Ad esempio, per ottenere 30 organoidi neurali umani, utilizzare un pallone T150 al 70%-80% di confluenza (circa 30 milioni di cellule).
5. Il giorno successivo (giorno 1), raccogli le sfere (con un P1000) e mettile in una piastra a 6 pozzetti. In ogni pozzetto, aggiungere 2 mL di terreno B27 e DMEM-F12 GlutaMAX e Neurobasal (miscelare a 1:1), integrati con l'1% di integratori di B27 e l'1% di aminoacidi non essenziali (NEAA). Per promuovere l'induzione neurale veloce, integrare il terreno con un cocktail di inibizione dual-SMAD (Sma and Mad Related Protein) composto da 10 μM di TGFβ (Transforming Growth Factor-beta)/Activina/Inibitore Nodale e 0,5 μM di inibitore della proteina morfogenica ossea (BMP). Da questo passo in avanti, le sfere vengono coltivate in rotazione (60 giri/min, agitatore orbitale). La rotazione è fondamentale per evitare che le sfere si attacchino tra loro o alla piastra.
6. Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni: piegare la piastra e lasciare cadere le sfere per 5 minuti, rimuovere metà del terreno (2 mL) e aggiungere 2 mL di terreno B27 fresco integrato con fattori di crescita e inibitori. Non centrifugare le sfere.
7. Eseguire l'induzione neurale secondo il seguente corso temporale:
   1. Dai giorni 1-4, la cultura le sfere in B27 medium integrato con dual-SMAD. Il cocktail di inibizione dual-SMAD (10 μM di TGFβ/Activina/Inibitore del Nodo e 0,5 μM di inibitore del BMP) promuove l'induzione neurale.
   2. Dal giorno 4 all'11, promuovere la proliferazione delle rosette neurali derivate da hESC (nelle sfere), aggiungendo 10 ng/mL di fattore di crescita epidermico (EGF) e 10 ng/mL di fattore di fibroblasti basici (bFGF) al terreno B27 integrato con doppio cocktail SMAD.
      nota: L'11° giorno, la maggior parte delle cellule dovrebbe essere positiva per la nestina.
   3. Dall'11° al 13° giorno, coltivare le sfere in terreno B27 integrate con un inibitore BMP da 0,5 μM.
   4. Dai giorni 13-21, le sfere sono state coltivate in terreno B27 integrato con 10 ng/mL di fattore neurotrofico derivato gliale (GDNF), 10 ng/mL di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) e 1 μM di inibitore della γ-secretasi. GDNF e BDNF promuovono la differenziazione neuronale e gliale. L'inibitore della γ-secretasi consente una maggiore maturazione neurale.
   5. Il giorno 21, piastrate le sfere (circa 1.000 sfere) su una membrana idrofila in politetrafluoroetilene (PTFE) (6 mm di diametro, 0,4 μm) depositata su un inserto per piastre di coltura progettato per piastre a 6 pozzetti. Arrestare qualsiasi rotazione da questo passaggio. La presenza di rosette, osservata con un microscopio a campo chiaro, indica l'inizio della differenziazione neurale. Le rosette neurali possono essere osservate 2-3 giorni dopo la placcatura delle sfere sulla membrana in PTFE.
   6. Aggiungere 1 mL di terreno B27 integrato con fattori di crescita e inibitori (come segue) a ciascun pozzetto sotto l'inserto della membrana, ogni 2-3 giorni (di solito il lunedì, mercoledì e venerdì), per le successive 3 settimane di differenziazione.
   7. Dal giorno 21 al 25, coltiva organoidi neurali umani nello stesso mezzo di maturazione neurale.
   8. Dal giorno 25 al 28, integrare il terreno B27 solo con 1 μM di inibitore della γ-secretasi.
   9. Dai giorni 28-39, interrompere l'aggiunta dell'inibitore della γ-secretasi e continuare la coltura di organoidi neurali umani solo nel terreno B27.
      nota: Dopo 3 settimane, gli organoidi neurali sono pronti per l'uso per l'impianto di GIC. Lungo la maturazione neurale, sono state osservate una diminuzione del marcatore neurale immaturo Nestin e un aumento dei marcatori neurali maturi β3-tubulina e GFAP.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a 6 pozzetti (piastra a 6 pozzetti)	Falco / Corning	07-201-588
Aggrewell 400 (Piastre di coltura per micropozzetti)	Tecnologie StemCell	Telefono 34421
Integratori di B27 (B27)	Tecnologie per la vita / Invitrogen	Ore 1238	Per entrambi i protocolli, soluzione madre 100x, soluzione finale 1x
Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)	Guida cellulare	GFH1-2	Per entrambi i protocolli, soluzione madre 100 μg/mL in H2O puro, soluzione finale 20 ng/mL
Composto E a inibitore della γ-secretasi (inibitore della γ-secretasi)	Calbiochem	CAS 209986-17-4	Per entrambi i protocolli (inibitore della gamma-secretasi XXI), soluzione madre 5 mM in DMSO, soluzione finale 1 μM
Dimetilsolfossido puro (DMSO)	Sigma-Aldrich	Visualizzazione del materiale C6164	Solvente composto, pronto all'uso
Eagle Medium modificato di Dulbecco (DMEM)	Tecnologie per la vita	Codice 12491-015	Per coltura cellulare, pronto all'uso
Dulbecco's Modified Eagle Miscela Media F-12 (DMEM-F12)	Gibco	11320033	Per coltura cellulare, pronto all'uso
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Tecnologie per la vita	AM9912	Per coltura cellulare, pronto all'uso
Fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali (GDNF)	Guida cellulare	GFH2-2	Per entrambi i protocolli, soluzione madre 100 μg/mL in H2O puro, soluzione finale 20 ng/mL
Membrana idrofila in politetrafluoroetilene (membrana in PTFE)	Interfaccia BioCell	Interrotto
LDN-193189 (inibitore BMP)	Axon Medchem /Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, soluzione stock 5 mM in DMSO, soluzione finale 0,5 μM
L-glutammina (L-glutammina)	Gibco	25030081	L-glutammina (200 mM), soluzione madre 200 mM, soluzione finale 2 mM
Matrigel (matrice extracellulare)	BD Bioscienze	354277	Matrice qualificata hESC, soluzione madre 18-22 mg/mL, soluzione finale 180-220 μg/mL
Inserto per piastra di coltura Millicell-CM (0,4 μm) (Inserto per piastra di coltura)	Millipore	PICM03050
Anticorpo monoclonale anti-β-tubulina III	sigma	T8660	Diluizione 1/1000
Agitatore orbitale MS, MS-NOR-30 (Agitatore orbitale)	Scienza principale	MS-NRC-30
Neurobasale (Neurobasale)	Tecnologie per la vita / Gibco	21103049	Mantenimento e maturazione di popolazioni di cellule neuronali embrionali, pronte all'uso
Aminoacidi non essenziali (NEAA)	Gibco	Codice: 11140	Aminoacidi non essenziali 100X, soluzione madre 100x, soluzione finale 1x
Anticorpo Nurr1 (M-196)	Santa Cruz	Codice SC-5568	1/100 di diluizione
Nutristem (terreno hESC )	Industrie Biologiche	05-100-1A	Terreni di coltura con cellule staminali, pronti all'uso
Penicilina / Streptomicina (Penicilina / Streptomicina )	Tecnologie per la vita / Gibco	15140122	Per colture cellulari, soluzione madre 5 mg/mL, soluzione finale 50 μg/mL
Soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca2+/Mg2+ (PBS senza Ca2+/Mg2+)	Tecnologie per la vita	14190250	Per coltura cellulare, pronto all'uso
chinasi Rho-associata Y-27632 (ROCK)	Abcam Biochemicals	AB120129-1	Blocco inibitorio, soluzione madre 50 mM in DMSO, soluzione finale 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activina/Inibitore linfonodale)	salita	Asc- 163	Dual-Smad, soluzione stock 50 mM in DMSO, soluzione finale 10 μM
StemPro Accutase (soluzione enzimatica hESC)	Gibco	Codice A11105-01	Soluzione enzimatica hESC, pronta all'uso
Pallone T150 (pallone T150)	Falcone	08-772-1F
Fattori di crescita trasformanti beta 3 (TGFβ3)	Guida cellulare	GFH109-2	Per il protocollo dopaminergico, soluzione madre 100 μg/mL in etanolo puro, soluzione finale 1 ng/mL
Tripsina 0,25% (soluzione enzimatica)	Tecnologie per la vita	15050065	soluzione enzimatica, pronta all'uso
X-vivo (terreno privo di siero)	Lonza	BE04-743Q	Terreno senza siero, pronto per te