Generazione di organoidi neuronali dopaminergici da cellule staminali embrionali umane

Abstract

Fonte: Cosset, E. et al. Organoidi neurali umani per lo studio del cancro al cervello e delle malattie neurodegenerative. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) in neuroni dopaminergici, per fornire un modello per lo studio del morbo di Parkinson. Le hESC vengono coltivate in un mezzo di induzione neurale in una piastra a micropozzetti per formare neurosfere 3D. Questi vengono poi coltivati in un mezzo di induzione neurale per promuovere la differenziazione in neuroni progenitori dopaminergici. La maturazione finale dei neuroni avviene in un inserto di coltura in condizioni di interfaccia aria-liquido, dando luogo a organoidi 3D costituiti da neuroni dopaminergici maturi.

Protocollo

1. organoidi dopaminergici derivati da hESC per studi sul morbo di Parkinson (PD)

1. Giorno 0: Amplificare le hESC in coltura 2D fino al 60% di confluenza (giorno 0), quindi sostituire i terreni di coltura con cellule staminali utilizzati per mantenere le caratteristiche di pluripotenza delle hESC con un terreno privo di siero. Avviare l'induzione neurale integrando il terreno di coltura con 0,5 μM di inibitore della proteina morfogenetica ossea (BMP) e 10 μM di fattore di crescita trasformante beta (TGFβ)/activina/inibitore nodale (cocktail di inibizione dual-SMAD), quindi aggiungere 10 μM di inibitore della proteina chinasi associata a Rho (ROCK) per 24 ore per aumentare il tasso di sopravvivenza delle cellule durante il passaggio.
2. Giorno 1: Preparare la piastra per micropozzetti con 2,5 mL per pozzetto di terreno privo di siero integrato con 0,5 μM di inibitore BMP, 10 μM di TGFβ/Activina/Inibitore nodale e 10 μM di inibitore ROCK. Per specificare le cellule verso il pattern ventrale del tubo neurale, aggiungere 100 ng/mL di sonic hedgehog (SHH), 100 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti 8 (FGF8) e 2 μM di agonista levigato. Centrifugare la piastra (solo con terreno e senza celle) a 1200 x g per 5 minuti per rimuovere le bolle d'aria dai micropozzetti.
   1. Dopo 1 giorno di induzione neurale in 2D, rimuovere il terreno e lavare rapidamente con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) senza Ca²⁺/MgCl²⁺. Dissociare le colonie in sospensione a cellula singola aggiungendo 7,5 mL di soluzione enzimatica ricombinante in un pallone da 75 cm². Incubare per 2 minuti a 37 °C, quindi completare con 7,5 mL di miscela modificata di terreno Eagle/nutriente F-12 (DMEM-F12) di Dulbecco.
   2. Raccogliere la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e contare le cellule nello stesso terreno utilizzato per preparare la piastra a micropozzetti.
   3. Regolare il volume del mezzo per ottenere una sospensione cellulare che consenta di formare neurosfere contenenti 1000 cellule per micropozzetto (ad esempio, la piastra per micropozzetti utilizzata qui contiene 4.700 micropozzetti per pozzetto). Quindi, preparare 4,7 milioni di cellule in 2,5 mL di terreno e aggiungerlo ai precedenti 2,5 mL di terreno già inseriti nella piastra.
   4. Per distribuire correttamente le cellule in ciascun micropozzetto, agitare delicatamente la piastra e centrifugare la piastra per micropozzetti 300 x g per 5 minuti. Incubare la piastra a 37 °C per 24 ore per generare sfere.
3. Giorno 2: Sciacquare delicatamente i micropozzetti con il terreno e raccogliere, quindi trasferire le sfere in una piastra a sei pozzetti trattata con tessuto. Sostituire il terreno con il terreno neurobasale integrato con l'1% di B27, 1x aminoacidi non essenziali (NEAA), 2 mM di L-glutammina e l'1% di penicillina/streptomicina. Inoltre, aggiungere i fattori di regionalizzazione SHH, FGF8, l'agonista levigato e le piccole molecole di inibizione dual-SBAD.
   1. Porre le sfere in rotazione a 37 °C (60 giri/min, agitatore orbitale) e sostituire il semimedio appena integrato ogni 2-3 giorni.
4. Giorno 3: Per migliorare l'induzione neurale e convertirla in progenitori neurali con un'identità mesencefalica, integrare il terreno con 3 μM di inibitore della glicogeno sintasi chinasi-3 beta (GSK-3β), che attiva la via Wnt/β-catenina. Mantenere l'inibitore GSK-3β nel terreno fino al giorno 13. Diviso in due nuove piastre a 6 pozzetti trattate con tessuto per ridurre la densità delle sfere per pozzetto ed evitare l'aggregazione delle sfere.
   nota: All'ottavo giorno, la maggior parte delle cellule dovrebbe essere positiva per la nestina.
5. Giorno 8: Inizio della maturazione neurale: sostituire i fattori di regionalizzazione SHH, FGF8, l'agonista levigato e il cocktail di inibizione dual-SMAD con 0,5 mM di dibutirriladesina monofosfato ciclico (cAMP) (per favorire la maturazione), 20 nM di inibitore dell'istone deacetilasi (per l'uscita dal ciclo cellulare), 1 μM di inibitore della γ-secretasi e fattori di crescita, 10 ng/mL di fattore neurotrofico derivato da linea cellulare gliale (GDNF), 10 ng/mL di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), 1 ng/mL di fattore di crescita trasformante β3 (TGFβ3) e 5 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti 20 (FGF20) (entrambi favoriscono la sopravvivenza del progenitore dopaminergico [DA]). Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.
6. Giorno 21: Generare l'organoide neurale: seminare circa 100 neurosfere in condizioni di interfaccia aria-liquido su politetrafluoroetilene (membrana in PTFE, diametro 6 mm). Trasferire la membrana in un inserto per piastra di coltura (0,4 mm) e aggiungere 1,2 mL di terreno di maturazione neurale utilizzato per la differenziazione della neurosfera, come descritto in precedenza.
   1. Arrestare qualsiasi rotazione da questo passaggio. Cambiare il fluido ogni 2-3 giorni fino a raggiungere il punto di tempo di differenziazione richiesto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a 6 pozzetti (piastra a 6 pozzetti)	Falco / Corning	07-201-588
Aggrewell 400 (Piastre di coltura per micropozzetti)	Tecnologie StemCell	Telefono 34421
Integratori di B27 (B27)	Tecnologie per la vita / Invitrogen	Ore 1238	Per entrambi i protocolli, soluzione madre 100x, soluzione finale 1x
Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)	Guida cellulare	GFH1-2	Per entrambi i protocolli, soluzione madre 100 μg/mL in H2O puro, soluzione finale 20 ng/mL
CHIR-99021 (inibitore GSK-3β	Assone Medchem	Codice di identificazione CT99021	Per il protocollo dopaminergico, soluzione madre 7,5 mM in DMSO, soluzione finale 3 μM
Composto E a inibitore della γ-secretasi (inibitore della γ-secretasi)	Calbiochem	CAS 209986-17-4	Per entrambi i protocolli (inibitore della gamma-secretasi XXI), soluzione madre 5 mM in DMSO, soluzione finale 1 μM
Dibutirril-AMP ciclico (Dibutirril-cAMP)	sigma	D0627	Per il protocollo dopaminergico, soluzione madre 0,5 M in DMSO, soluzione finale 0,5 mM
Dulbecco's Modified Eagle Miscela Media F-12 (DMEM-F12)	Gibco	11320033	Per coltura cellulare, pronto all'uso
EDTA 0,1 mM (EDTA)	Tecnologie per la vita	AM9912	Per coltura cellulare, pronto all'uso
Fattore di crescita dei fibroblasti 20 (FGF20)	Peprotech	100-41	Per il protocollo dopaminergico, soluzione madre 100 μg/mL in H2O puro, soluzione finale 5 ng/mL
fattore di crescita dei fibroblasti 8 (FGF8)	Peprotech	GFH176-5	Per il protocollo dopaminergico, soluzione madre 100 μg/mL in H2O puro, soluzione finale 100 ng/mL
Fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali (GDNF)	Guida cellulare	GFH2-2	Per entrambi i protocolli, soluzione madre 100 μg/mL in H2O puro, soluzione finale 20 ng/mL
Membrana idrofila in politetrafluoroetilene (membrana in PTFE)	Interfaccia BioCell	Interrotto
LDN-193189 (inibitore BMP)	Axon Medchem /Stemgen	04-0072-02 /1509	Dual/Smad, soluzione stock 5 mM in DMSO, soluzione finale 0,5 μM
L-glutammina (L-glutammina)	Gibco	25030081	L-glutammina (200 mM), soluzione madre 200 mM, soluzione finale 2 mM
Inserto per piastra di coltura Millicell-CM (0,4 μm) (Inserto per piastra di coltura)	Millipore	PICM03050
Agitatore orbitale MS, MS-NOR-30 (Agitatore orbitale)	Scienza principale	MS-NRC-30
Integratori di N2 (N2)	Invitrogen	Codice 17502-048	Per coltura GIC, soluzione madre 100x, soluzione finale 1x
Neurobasale (Neurobasale)	Tecnologie per la vita / Gibco	21103049	Mantenimento e maturazione di popolazioni di cellule neuronali embrionali, pronte all'uso
Aminoacidi non essenziali (NEAA)	Gibco	Codice: 11140	Aminoacidi non essenziali 100X, soluzione madre 100x, soluzione finale 1x
Nutristem (terreno hESC )	Industrie Biologiche	05-100-1A	Terreni di coltura con cellule staminali, pronti all'uso
Penicilina / Streptomicina (Penicilina / Streptomicina )	Tecnologie per la vita / Gibco	15140122	Per colture cellulari, soluzione madre 5 mg/mL, soluzione finale 50 μg/mL
Soluzione salina tamponata con fosfato senza Ca2+/Mg2+ (PBS senza Ca2+/ Mg2+)	Tecnologie per la vita	14190250	Per coltura cellulare, pronto all'uso
Purmorfemina (agonista levigato)	Calbiochem	SML0868	Per il protocollo dopaminergico, soluzione madre 10 mM in DMSO, soluzione finale 2 μM
chinasi Rho-associata Y-27632 (ROCK)	Abcam Biochemicals	AB120129-1	Blocco inibitorio, soluzione madre 50 mM in DMSO, soluzione finale 10 μM
SB-431542 (TGFβ/Activina/Inibitore linfonodale)	salita	Asc- 163	Dual-Smad, soluzione stock 50 mM in DMSO, soluzione finale 10 μM
Riccio sonico (SHH)	Guida cellulare	GFH168-5	Per il protocollo dopaminergico, soluzione madre 100 μg/mL in H2O puro, soluzione finale 100 ng/mL
StemPro Accutase (soluzione enzimatica hESC)	Gibco	Codice A11105-01	Soluzione enzimatica hESC, pronta all'uso
Pallone T150 (pallone T150)	Falcone	08-772-1F
Fattori di crescita trasformanti beta 3 (TGFβ3)	Guida cellulare	GFH109-2	Per il protocollo dopaminergico, soluzione madre 100 μg/mL in etanolo puro, soluzione finale 1 ng/mL
Tricostatina A (inibitore dell'istone deacetilasi)	sigma	Codice: T8552	Per il protocollo dopaminergico, soluzione madre 100 μM in DMSO, soluzione finale 20 nM
TrypLE (soluzione enzimatica ricombinante)	Invitrogen	12604021	Soluzione enzimatica ricombinante, pronta all'uso
Tripsina 0,25% (soluzione enzimatica)	Tecnologie per la vita	15050065	soluzione enzimatica, pronta all'uso
X-vivo (terreno privo di siero)	Lonza	BE04-743Q	terreno privo di siero, pronto all'uso

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