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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Instaurazione dell'infarto nel ponte
- Preriscaldare il termoforo immediatamente prima dell'anestesia.
- Fissare il trapano per cranio al supporto sul telaio stereotassico.
- Iniettare intraperitonealmente nei ratti 50 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina. Verificare la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita.
- Montare il ratto sul telaio stereotassico in posizione prona. Posizionare le barre auricolari sopra il condotto uditivo per fissare la testa. Assicurarsi che il cranio sia mantenuto orizzontale per evitare qualsiasi inclinazione dell'iniezione.
- Mantenere l'anestesia con isoflurano (100% ossigeno, 2,5% isoflurano) tramite un attacco stereotassico per il naso per ratti con porte di ingresso e uscita. Utilizzare un termoforo per mantenere la temperatura a 37 °C e monitorarla durante tutta la procedura.
- Usa un unguento per gli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea. Usa una pinza per pizzicare le zampe per assicurarti che non risponda leggermente al dolore.
- Radere i peli del cranio con un micro-rasoio. Applicare circolarmente lo scrub chirurgico alla clorexidina iniziando dal sito dell'incisione chirurgica e ruotando verso l'esterno.
- Praticare un'incisione della linea mediana di 3 cm con un bisturi dalla linea del canto laterale bilaterale a 0,5 cm dietro la fontanella posteriore, che un pennarello chirurgico dovrebbe segnare.
- Usa un batuffolo di cotone per rimuovere il sangue.
- Un pezzo di nastro chirurgico deve essere posizionato su ciascun lato del lembo cutaneo per esporre il cuoio capelluto (Figura 1).
- Rimuovere delicatamente i tessuti connettivi dall'osso del cranio con un batuffolo di cotone imbevuto di NaCl allo 0,9%. Se non vengono rimossi, i tessuti connettivi rimarranno impigliati nel trapano.
- Identifica il bregma. Scegli il punto centrale del bregma come punto di origine e segnalo con un pennarello chirurgico nero a punta fine.
- Posizionare un trapano a 6.0 mm AP, 2.0 mm ML (intervallo da 0.5 a 3.0 mm, Figura 2A).
- Eseguire la craniotomia (diametro 1 mm) utilizzando un trapano automatico. Procedi con cautela perché questo punto è vicino al seno venoso.
- Rimuovere il trapano dal telaio stereotassico.
- Posizionare una sonda da 22 G con una guaina isolata nel telaio stereotassico (Figura 3A). La punta della sonda deve essere posizionata 2 mm sopra l'estremità prossimale della guaina (Figura 3A, B; Figura 2B).
- Assicurarsi che la guaina entri nel cervello a 7 mm (7 mm DV, Figura 2B; Figura 1C).
- Far avanzare la sonda lungo la guaina (Figura 1D) fino a quando la punta della sonda si trova 9 mm sotto la superficie del cervello (Figura 2D).
- Collegare gli elettrodi a uno stimolatore elettrico (Figura 3C). Collegare l'anodo alla sonda come mostrato nella Figura 1D. Collegare il catodo ai ratti (di solito all'orecchio dei ratti).
- Accendere lo stimolatore elettrico e impostare i seguenti parametri: larghezza dell'impulso singolo = 4.050 ms; tensione = 50 V; corrente = 4 mA (Figura 3C). Durante la stimolazione elettrica, il ratto mostrerà tremore. In questo studio, il dispositivo non è stato acceso per i ratti del gruppo di controllo utilizzati per i test comportamentali, la risonanza magnetica e il TTC.
- Lasciare la sonda in posizione per 5 minuti dopo la stimolazione.
- Rimuovere la sonda dal cervello (Figura 1F).
- Usa il cemento osseo per coprire la craniotomia. Lasciare asciugare il cemento prima di suturare la ferita.
- Sutura la ferita con filamenti di sutura in poliammide 4-0. Dopo tre o quattro punti, fare i nodi chirurgici standard 2-1-1.
- Iniettare nei ratti penicillina (0,25 mL, 80 UI diluiti in 4 mL di soluzione fisiologica) per via intraperitoneale per prevenire l'infezione.
- Iniettare nei ratti per via sottocutanea meloxicam alla dose di 2 mg/kg e poi ripetere l'operazione ogni 24 ore.
- Monitora i ratti ogni 15 minuti fino a quando non si svegliano completamente e rimettili nella gabbia con un termoforo. Fornire libero accesso al cibo e all'acqua fino al sacrificio.
nota: Tutte le procedure devono seguire i principi della chirurgia asettica. Prima dell'intervento, indossare un top scrub, una maschera chirurgica e guanti sterili dopo uno scrub chirurgico delle mani. Mantenere sempre il materiale di sutura sterile all'interno del campo sterile.
