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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Cateterismo arterioso
- Anestetizzare il topo con un'iniezione intraperitoneale di ketamina e xilazina e un analgesico secondo la pratica locale (ad es. buprenorfina). Pizzicare gli arti posteriori con una pinza per confermare la corretta profondità dell'anestesia.
nota: Per questo studio, sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6N all'età di 8-12 settimane (peso 20-25 g). Gli autori hanno testato senza successo BALB/c maschi della stessa età, ma non hanno provato altri ceppi.
- Rimuovere i peli nelle zone di interesse (testa, collo) utilizzando un rasoio elettrico. Assicurarsi che non rimangano peli sciolti per evitare la contaminazione della ferita. Successivamente, disinfettare il campo chirurgico con etanolo al 70%/clorexidina/betadina e posizionare il topo supino con la testa rivolta verso il chirurgo.
- Praticare un'incisione sulla linea mediana cervicale con le forbici da dissezione.
- Sezionare le ghiandole sottomandibolari e il tessuto muscolare del collo e separarli per esporre l'arteria carotide comune. Utilizzare principalmente la dissezione smussata tramite pincipe.
- Piazzamento tre 8-0 legature di seta sotto l'arteria carotide comune destra.
- Posizionare un morsetto sulla legatura prossimale e portare la tensione nell'arteria in modo che il flusso sia sospeso.
- Chiudere la legatura più distale.
- Inserire il catetere arterioso attraverso un piccolo foro cutaneo preformato sulla faccia cranica dell'incisione. Stringere e deformare il lume del catetere se appare troppo grande per ridurre il riflusso sanguigno. Fissare con tutte e tre le legature.
- Fissare il catetere alla pelle per evitare la lussazione. A tale scopo, utilizzare una sutura (ad es. monofilamento 5-0, non assorbibile) che collega il catetere alla pelle nell'area del foro cutaneo preformato.
2. Tracheostomia
- Sezionare la muscolatura pre-tracheale senza mezzi termini usando una pinza.
- Piazzare due 8-0 legature di seta sotto la trachea.
- Tracheotomizzare utilizzando le micro forbici il più prossimalmente possibile per evitare la ventilazione unilaterale. Utilizzare una linea di taglio orizzontale tra due cartilagini tracheali.
- Inserire il tubo di ventilazione e fissarlo con entrambe le legature preparate.
nota: L'estremità prossimale della trachea non ha bisogno di essere legata.
- Chiudere la pelle con una sutura in esecuzione (ad es. monofilamento 6-0, non assorbibile).
- Ventilare il mouse con una frequenza di 150/min e un volume corrente di 200 μl.
3. Induzione della morte cerebrale (BD)
- Disporre il mouse in posizione prona.
- Rimuovere la pelle dal cranio usando forbici chirurgiche e pinze per trattenere la pelle.
- Praticare un foro di calibro 1 mm paramedialmente sopra la corteccia parietale sinistra. Interrompere la perforazione prima di rompere l'osso compatto interno e la dura madre.
- Penetrare il ponte tissutale finale del cranio utilizzando una pinza smussata, rimuovendo gli spigoli vivi.
- Inserire il catetere a palloncino, in modo che sia interamente all'interno della cavità cranica. Assicurarsi che il palloncino sia preriempito di soluzione salina e che tutta l'aria sia evacuata.
- Iniziare il gonfiaggio a ~0,1 mL/min per un periodo di 10-15 min (volume totale di 0,8-1,2 mL) con l'aiuto di una pompa a siringa.
nota: Il topo mostrerà mioclono, midriasi, ulteriore attività convulsiva e rantoli agonali.
- Dichiara morto il cervello del topo una volta che la coda del topo si è irrigidita ed eretta.
nota: La BD è confermata da un caratteristico picco iniziale di pressione sanguigna (riflesso di Cushing), dall'assenza di riflessi del tronco encefalico e dalla respirazione spontanea. I test regolari dell'apnea dovrebbero essere evitati durante gli esperimenti, poiché i topi possono diventare instabili circolatori a causa della mancanza di ossigeno.
- Arrestare il gonfiaggio del catetere a palloncino.
- Metti una coperta riscaldante sul topo per evitare l'ipotermia.