NOTA: Le linee transgeniche utilizzate in questo studio includono il lignaggio specifico per i macrofagi mpeg1:mCherry (costruito internamente), mpo specifico per i neutrofili: GFP, gata1:dsRed specifico per eritroide e ubiq:secAnnexinV-mVenus, un reporter per la morte cellulare (riderivato in casa) su sfondi wild-type, madreperla (mitfaw2/w2) e mutanti (bbhm292).
1. Giorno 0: Produzione e raccolta degli ovuli
- Raccogli embrioni fecondati dalla deposizione naturale delle uova in scatole di riproduzione prodotte da 1 maschio e 1-2 femmine di pesce zebra adulto.
nota: Per il protocollo dell'atorvastatina, può essere utilizzato qualsiasi animale wildtype/transgenico; Tuttavia, i tassi di emorragia differiscono leggermente tra i ceppi.
- Incubare 100 embrioni a 28 °C in terreno embrionale standard E3 per piastra di Petri e stadiare secondo le linee guida standard.
- A ~6 ore dopo la fecondazione (hpf), rimuovere gli embrioni morti e non fecondati dal piatto utilizzando una pipetta Pasteur. La Figura 1 mostra la cronologia sperimentale.
2. Giorno 1: Trattamento con atorvastatina a 24 hpf
- Embrioni dechorionati per il trattamento con atorvastatina utilizzando pinze da dissezione affilate e ultrasottili. I numeri necessari per la sperimentazione possono essere regolati di conseguenza.
- Aggiungere 30 ml di terreno embrionale E3 a due piastre di Petri pulite. Utilizzare un piatto per 100 embrioni.
nota: Se le piastre sono progettate per la coltura cellulare, il pesce zebra dechorionato in questa fase iniziale spesso si attacca al fondo. Per evitare ciò, sciacquare accuratamente le piastre in acqua pulita prima dell'uso.
- Rimuovere 60 μL di acqua dell'embrione dalla piastra di trattamento e aggiungere 60 μL di atorvastatina (ATV) 0,5 mM. A una concentrazione di 0,5 mM, la diluizione di cui sopra si tradurrà in una concentrazione finale di 1 μM, con conseguente ~20% delle larve non emorragiche (ICH-) e ~80% delle larve emorragiche (ICH+). Utilizzare l'altra piastra per controlli non trattati.
nota: L'atorvastatina viene solubilizzata in acqua distillata (3 mg in 10 mL) per ottenere una soluzione madre 0,5 mM. Incubare per una notte a temperatura ambiente al buio con agitazione poiché la solubilizzazione richiede un po' di tempo. La solubilizzazione completa può richiedere fino a 1 settimana. Non utilizzare DMSO (dimetilsolfossido). La soluzione viene aliquotata e conservata a -20°C. Non congelare-scongelare.
- Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire 100 embrioni nella minor quantità d'acqua possibile nelle piastre di trattamento.
- Incubare le piastre a 28 °C.
nota: L'ICH (emorragia intracerebrale) si verificherà tra 33 e 48 hpf. Non è necessario rimuovere l'atorvastatina poiché un'incubazione superiore a 24 ore non causa ulteriori problemi di sviluppo.
3. Giorno 2: Separazione delle popolazioni ICH- e ICH+ a 50 hpf
- Separa i pesci ICH+ dalle popolazioni ICH e trasferiscili in nuovi piatti per facilità.
- Se si utilizza il modello ATV a una concentrazione di 1 μM, il 75-100% delle larve presenterà un'emorragia (ICH+) in questo momento.
nota: La risposta delle larve differisce tra i ceppi, se le larve non hanno un'emorragia alle frequenze desiderate, utilizzare un nuovo lotto di atorvastatina o una concentrazione più elevata. Se le larve non hanno mostrato emorragia di 48 hpf, consideratele ICH-.
- Se si utilizza il modello bbh, tutti i mutanti omozigoti mostreranno un'emorragia di 48 hpf. Se si utilizza un incross eterozigote, i fratelli eterozigoti e wild-type ICH possono essere utilizzati come animali di controllo per gli esperimenti.
- Se necessario, anestetizzare le larve aggiungendo lo 0,02% di MS222 al terreno E3. Utilizzando una pipetta Pasteur, selezionare le larve per la presenza di sangue nella testa in terreni E3 freschi. Vedere la Figura 2.
nota: Il sangue nella testa può comparire nel mesencefalo anteriore, medio o posteriore o in combinazione e il volume del sanguinamento può variare tra gli animali. Nei mutanti bbh, l'ICH è spesso associato a un grave edema, riconoscibile da teste più grandi, spazio più ampio tra gli occhi e un sanguinamento più diffuso. Tuttavia, non tutte le larve di ICH+ bbh presentano edema.
