Colorazione immunofluorescente di sialoglicoproteine in cellule progenitrici neurali e neuroni

Abstract

Fonte: Bai, Q., et al., Identificazione dei marcatori della superficie cellulare delle cellule staminali neurali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica del sialoglycan. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la biotinilazione e la marcatura fluorescente di sialoglicoproteine modificate in cellule staminali neurali primarie e progenitrici, nonché neuroni, e la loro visualizzazione utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Protocollo

1. Colorazione immunofluorescente di sialoglicoproteine in NSPC primarie espanse e neuroni differenziati

1. Preparare il complesso BTTAA-CuSO₄ 1 30x contenente 1,5 mM di CuSO₄ e 9 mM di BTTAA in acqua bidistillata. Preparare un tampone 1 coniugato con biotina appena contenente 50 μM di biotina-alchino, 2,5 mM di ascorbato di sodio e 1x complesso BTTAA-CuSO₄ in PBS.
2. Rimuovere gli inserti dalle piastre di co-coltura. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti inferiori e lavare una volta le cellule neurali con PBS preriscaldato.
3. Aspirare il PBS dai pozzi. Aggiungere 1 mL di soluzione pre-ref....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siero fetale bovino	Gibco	10099141	10%
Paraformaldeide	sigma	158127	4%
DAPI	Gibco	Codice 62248
Piastra a 6 pozzetti	Corning	Telefono 3335
Monoclonale di topo anti-Nidina	Studio sullo sviluppo Banca degli ibridomi	Ratto-401	da 1 a 20
Anti-beta-tubulina III monoclonale di topo	sigma	T8860	da 1 a 1000
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG1	Invitrogen	A-21121	da 1 a 1000
Alexa Fluor 546 capra anti-topo IgG2b	Invitrogen	Codice A-21143	da 1 a 1000
Triton X-100	Amresco	694
Solfato di rame	sigma	209198
Alchino-biotina	Fare clic su Strumenti di chimica	TA105
BTTAA	Fare clic su Strumenti di chimica	Ore 1236
ascorbato di sodio	sigma	Codice: A4034
Alexa Farina 647-streptavidina coniugata	Invitrogen	S21374	da 1 a 1000