Colorazione immunofluorescente di sialoglicoproteine in cellule progenitrici neurali e neuroni

Abstract

Fonte: Bai, Q., et al., Identificazione dei marcatori della superficie cellulare delle cellule staminali neurali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica del sialoglycan. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la biotinilazione e la marcatura fluorescente di sialoglicoproteine modificate in cellule staminali neurali primarie e progenitrici, nonché neuroni, e la loro visualizzazione utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Protocollo

1. Colorazione immunofluorescente di sialoglicoproteine in NSPC primarie espanse e neuroni differenziati

1. Preparare il complesso BTTAA-CuSO₄ 1 30x contenente 1,5 mM di CuSO₄ e 9 mM di BTTAA in acqua bidistillata. Preparare un tampone 1 coniugato con biotina appena contenente 50 μM di biotina-alchino, 2,5 mM di ascorbato di sodio e 1x complesso BTTAA-CuSO₄ in PBS.
2. Rimuovere gli inserti dalle piastre di co-coltura. Aspirare il terreno di coltura dai pozzetti inferiori e lavare una volta le cellule neurali con PBS preriscaldato.
3. Aspirare il PBS dai pozzi. Aggiungere 1 mL di soluzione pre-refrigerata di PBS di paraformaldeide al 4% per pozzetto alle cellule e fissarle a RT per 10 minuti. Quindi, lavare le celle 3 volte con PBS pre-raffreddato.
4. Aspirare il PBS dai pozzetti e aggiungere 1 mL di tampone coniugato con biotina appena preparato 1 per pozzetto nelle cellule. Incubare le cellule a RT per 10 minuti.
5. Aspirare il tampone di reazione dai pozzetti. Lavare le celle 3 volte con PBS. Preparare il tampone di colorazione contenente l'1% di FBS e 1 μg/mL di Alexa Fluor 647-streptavidina. Aggiungere 1 mL di tampone di colorazione per pozzetto nelle cellule e incubare le cellule a RT per 30 minuti.
6. Aspirare il tampone di colorazione dai pozzetti e lavare le celle 3 volte con PBS pre-raffreddato. Preparare il tampone bloccante contenente il 5% di BSA e lo 0,3% di detergente non ionico-100 in PBS. Aggiungere 1 mL di tampone bloccante per pozzetto nelle cellule e incubare a RT per 10 minuti.
7. Preparare una soluzione di anticorpi primari diluendo gli anticorpi anti-nestina e anti-β-tubulina III insieme nel tampone bloccante in rapporti rispettivamente di 1:20 e 1:1.000. Rimuovere il tampone bloccante dai pozzetti e aggiungere 1 mL di soluzione di anticorpi primari per pozzetto nelle cellule. Incubare le cellule a 4 °C per una notte.
8. Rimuovere la soluzione di anticorpi primari dai pozzetti. Lavare le celle 3 volte con PBS pre-raffreddato. Preparare una soluzione di anticorpi secondari diluendo Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG1, Alexa Fluor 546 capra anti-topo IgG2b e DAPI insieme in tampone bloccante a una diluizione di 1:1.000. Aspirare il PBS dai pozzetti e aggiungere 1 mL di soluzione di anticorpi secondari per pozzetto nelle cellule. Incubare le cellule a RT per 2 ore.
9. Aspirare la soluzione anticorpale dai pozzetti e lavare le cellule 3 volte con PBS pre-raffreddato. Successivamente, le celle sono pronte per l'acquisizione dell'immagine.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Siero fetale bovino	Gibco	10099141	10%
Paraformaldeide	sigma	158127	4%
DAPI	Gibco	Codice 62248
Piastra a 6 pozzetti	Corning	Telefono 3335
Monoclonale di topo anti-Nidina	Studio sullo sviluppo Banca degli ibridomi	Ratto-401	da 1 a 20
Anti-beta-tubulina III monoclonale di topo	sigma	T8860	da 1 a 1000
Alexa Fluor 488 capra anti-topo IgG1	Invitrogen	A-21121	da 1 a 1000
Alexa Fluor 546 capra anti-topo IgG2b	Invitrogen	Codice A-21143	da 1 a 1000
Triton X-100	Amresco	694
Solfato di rame	sigma	209198
Alchino-biotina	Fare clic su Strumenti di chimica	TA105
BTTAA	Fare clic su Strumenti di chimica	Ore 1236
ascorbato di sodio	sigma	Codice: A4034
Alexa Farina 647-streptavidina coniugata	Invitrogen	S21374	da 1 a 1000