Valutazione in vitro dell'amiloide-β aggregata sul collasso del cono di crescita neuronale

Abstract

Fonte: Kuboyama, T. Visualizzazione del collasso del cono di crescita assonale e degli effetti precoci dell'amiloide β nei neuroni di topo in coltura. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra una valutazione in vitro del collasso del cono di crescita neuronale da parte di aggregati di amiloide-β (Aβ). Il trattamento dei neuroni con aggregati Aβ provoca la destabilizzazione del citoscheletro, portando al collasso dei coni di crescita sulla punta degli assoni. Le cellule trattate vengono confrontate con le cellule di controllo per valutare l'entità del collasso del cono di crescita.

Protocollo

1. Collapse Assay

1. Colorazione della poli-D-lisina
   1. Rivestire i vetrini di coltura a 8 pozzetti con 400 μL di poli-D-lisina (PDL) da 5 μg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e incubarli a 37 °C per una notte.
   2. Rimuovere la soluzione PDL e lavare i pozzetti 3 volte con acqua distillata.
2. Coltura neuronale
   1. Tritare le cortecce cerebrali appena isolate da topi embrionali al giorno 14 (E14) ddY (Deutschland, Denken e Yoken) con microforbici in terreno di coltura neuronale contenente il 12% di siero equino, lo 0,6% di glucosio e 2 mM di L-glutammina (terreno A). Non aggiungere antibiotici.
      nota: In questo protocollo, viene utilizzato il mouse ddY. Si tratta di una varietà di razza comunemente usata in Giappone. Questo protocollo di coltura neuronale può essere applicato anche ai neuroni corticali di ratto.
   2. Centrifugare i fazzoletti a 87 x g per 3 minuti.
   3. Rimuovere il surnatante. Quindi, aggiungere 2 mL di tripsina allo 0,05% e incubare per 15 minuti a 37°C. Mescolare picchiettando ogni 5 minuti.
   4. Aggiungere 4 ml di terreno A e mescolare picchiettando.
   5. Centrifugare i fazzoletti a 178 x g per 3 min.
   6. Rimuovere il surnatante e incubare i tessuti con 600 U/mL di desossiribonucleasi I (DNasi I) e 0,3 mg/mL di inibitore della tripsina di soia disciolti in PBS per 15 minuti a 37 °C. Mescolare picchiettando ogni 5 minuti.
   7. Dopo l'incubazione, aggiungere 4 mL di terreno A e mescolare picchiettando.
   8. Centrifugare i fazzoletti a 178 x g per 3 min.
   9. Dopo aver rimosso il surnatante, aggiungere 4 ml di terreno A e triturare i tessuti con una pipetta Pasteur lucidata.
   10. Filtrare i tessuti triturati con una rete di dimensioni dei pori di 70 μm. Dopo la filtrazione, calcolare la densità delle cellule con un emocitometro.
   11. Colture di cellule nel vetrino di coltura a 8 pozzetti a 0,8 x 10⁴ cellule/pozzetto con terreno A e conservazione in un incubatore di CO₂ con un'atmosfera umidificata del 10% di CO₂ a 37 °C.
   12. Dopo 4 ore di coltura, sostituire il terreno di coltura con uno contenente il 2% di integratore per la coltura neuronale, lo 0,6% di glucosio e 2 mM di L-glutammina (terreno B).
       nota: La purezza dei neuroni era di circa il 75%, come descritto in precedenza.
3. Saggio di collasso
   1. Sciogliere l'amiloide β1-42 (Aβ1-42) ottenuta commercialmente in acqua distillata a una concentrazione di 0,5 mM e incubare a 37 °C per 7 giorni. Dopo l'incubazione, conservare la soluzione aggregata di Aβ1-42 in un congelatore a -30 °C fino al momento dell'uso.
      nota: Questa incubazione è necessaria per l'aggregazione e la tossicità di Aβ.
   2. Dopo 4 giorni di coltura neuronale, trattare i pozzetti con 100 μL di nuovo terreno B, contenente 0,5 μM aggregato di Aβ1-42 o soluzione veicolo (acqua distillata) per 1 h.
      nota: Gli effetti di Aβ1-42 sono aumentati in modo dose-dipendente da 0,1 a 5 μM e hanno raggiunto un picco a 0,5 μM come descritto in precedenza. Risultati simili possono essere osservati con il trattamento con Aβ1-42 per 1 ora dopo 3 giorni di coltura neuronale.
   3. Rimuovere il terreno di coltura e fissare immediatamente i neuroni con paraformaldeide al 4% contenente il 4% di saccarosio in PBS per 1 ora a 37 °C su una piastra calda.
   4. Dopo la fissazione, lavare i neuroni 3 volte con PBS e montarli con un mezzo di montaggio acquoso. Asciugare il mezzo di montaggio a 4 °C per 2-4 giorni.
   5. Cattura l'intera area (7,8 x 9 mm²) di ciascun pozzetto con una lente dell'obiettivo a secco 20X su un microscopio invertito.
   6. Classificare i neuriti più lunghi di ciascun neurone allo stadio 3 o 4 come assoni, come descritto in precedenza.
   7. Classificare i coni di crescita secondo i seguenti criteri: 1) i coni di crescita assonali privi di lamellipodi o 2) che possiedono meno di tre filopodi sono considerati coni di crescita collassati, come descritto in precedenza.
      nota: I coni di crescita sani sono valutati come 0 punti; I coni di crescita collassati sono valutati come 1 punto. I punteggi medi di collasso sono calcolati per ogni trattamento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ddY topi	Slc
Scivolo di coltura a otto pozzetti	Falcone	354108
poli D lisina	Wako	Codice 168-19041
Terreno di coltura, terreno neurobasale	Gibco	Codice 21103-049
siero per la casa	Gibco	Codice 26050-088
glucosio	Wako	Codice 049-31165
L-glutammina	Wako	Codice 074-00522
0,05% tripsina	Gibco	Codice 25300-054
DNasi I	Worthington	Dp
inibitore della tripsina della soia	Gibco	Codice 17075-029
Filtro con maglia da 70 μm, filtro a celle	Falcone	Codice 352350
Supplemento B-27	Gibco	Codice 17504-044
Incubatore a CO2	Astec	SCA-165DS
Amiloide β1-42	Sigma-Aldrich	Codice: A9810
di paraformaldeide	Wako	Codice 162-16065
saccarosio	Wako	Codice 196-00015
Mezzo di montaggio acquoso, AquaPoly/Montatura	Poliscienze	Codice: 18606-20
Microscopio invertito A	Carl Zeiss	Axio Observer Z1	Collegato con AxioCam MRm, unità di riscaldamento XL S, modulo CO2 S1 e TempModule S1
Obiettivo Plan-Apochromat 20x	Carl Zeiss	Numero 420650-9901