Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione di sezioni di tessuto per la spettrometria di massa per imaging (IMS)
- Elaborazione di un campione di tessuto di un cervello umano sottoposto ad autopsia<br />
nota: Assicurarsi che la fase di preparazione del campione per l'IMS preservi lo stato originale del tessuto. Evita la contaminazione e le modifiche post mortem. Il passaggio successivo è fondamentale.
- Ottenere campioni corticali umani per l'IMS da cervelli che sono stati rimossi, elaborati e conservati a -80 °C entro 8 ore post mortem. Prelevare il campione di cervello dalla corteccia occipitale dei pazienti con malattia di Alzheimer (AD) e dei controlli di pari età.
- Preparazione di sezioni di tessuto congelate
- Tagliare le sezioni di tessuto su un criostato. Posizionare i vetrini da microscopio rivestiti di ossido di indio-stagno (ITO) conduttivo all'interno del criostato.
- Riscaldare il campione cerebrale dell'autopsia da -80 °C a -22 °C all'interno del criostato.
- Attacca una nuova lama usa e getta al criostato per ogni esperimento. Cercare sempre di utilizzare una parte pulita della lama.
- Mettere i cervelli congelati dell'autopsia sul tavolino insieme a una piccola quantità di composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) (sufficiente a coprire l'area centrale del tavolino; vedi Tabella dei materiali).
- Scegliere le condizioni per il sezionamento sottile. Per l'IMS, utilizzare uno spessore di 10-12 μm per le sezioni del cervello umano. Per l'IMS e l'immunoistochimica (IHC), tagliare da cinque a sei sezioni da ciascun campione di tessuto.
- Quando la lama sta appena iniziando a tagliare il tessuto, gira la rotella e "affronta" il blocco fino a quando tutto il tessuto è esposto. Se c'è una piccola striscia o strappo attraverso la sezione, attendere ancora un po' nel criostato fino a quando la regolazione della temperatura non lo risolve automaticamente. Conta qualche secondo prima di aprire l'antirollio con un fazzoletto sotto.
- Posizionare immediatamente la fetta di tessuto sul lato rivestito di ITO del vetrino. Scongelare la fetta di tessuto mettendo un dito sotto il vetrino sul lato non rivestito di ITO. Il fazzoletto si attaccherà al vetrino; Assicurarsi che il tessuto sia il più piatto possibile senza rughe. Eseguire questo passaggio a temperatura ambiente.
nota: Indossa guanti, maschere e un camice da laboratorio perché i campioni umani possono contenere contaminanti biologici. Quando tutte le sezioni sono state realizzate per la giornata, pulire il criostato, le spazzole e i mandrini con salviette da laboratorio e 200 ml di etanolo al 100%.
- Risciacquo delle sezioni di tessuto
- Immergere i campioni in 40-100 ml di etanolo al 70% per 30 s per rimuovere i lipidi endogeni e i sali inorganici. Usa un barattolo di vetro.
- Lavare i campioni con 40-100 mL di etanolo al 100% per 30 s, 40-100 mL di soluzione di Carnoy per 3 min, 40-100 mL di etanolo al 100% per 30 s, 40-100 mL di acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,1% per 1 min e 40-100 mL di etanolo al 100% per 30 s. Utilizzare un barattolo per colorare il vetro.
nota: La soluzione di Carnoy è un fissativo composto da sei parti di etanolo, tre parti di acido acetico e una parte di cloroformio.
- Asciugare sottovuoto per 30 min.
- Trattamento delle sezioni di tessuto con un vapore di acido formico per una migliore ionizzazione delle proteine Aβ dai tessuti cerebrali autoptici
- Preparare il vetrino da forno e da incubare da utilizzare per la successiva vaporizzazione con 5 mL di acido formico al 100%. Per ottenere un trattamento acido soddisfacente, mantenere l'umidità dell'aria nella capsula di vetro di incubazione al livello di saturazione durante questa fase e mantenere la temperatura a 60 °C. Posizionare i vetrini di tessuto nella capsula di vetro per l'incubazione evitando l'immersione nell'acido formico e trattare per 6 minuti.
- Acquisire un'immagine ottica dei campioni utilizzando uno scanner per pellicole, uno scanner per gel o un microscopio digitale, ecc. Eseguire questo passaggio a temperatura ambiente. L'allineamento dell'immagine ottica dei campioni è necessario quando il target del campione è posizionato all'interno dello strumento. Di solito, non sarà possibile riconoscere la sezione di tessuto sotto lo strato della matrice.
NOTA: Il modo più conveniente per scattare un'immagine ottica è utilizzare uno scanner da ufficio. È consigliabile salvare l'immagine nella cartella di archiviazione dei dati di imaging.
- Per correlare le immagini ottiche con i campioni, tracciare dei segni guida visibili sia nell'immagine ottica che sotto lo strato della matrice nell'ottica della fotocamera. Il modo più semplice è individuare almeno tre segni di liquido correttivo attorno al campione prima di scattare l'immagine ottica.
- Applicazione a matrice
- Preparazione della soluzione di matrice
- In una microprovetta tollerante ai solventi organici, preparare una soluzione di acido sinapinico (SA) da 10 mg/mL in acetonitrile (ACN) al 50% e TFA allo 0,1%. Sciogliere completamente il composto SA mediante vortice o breve sonicazione per 10 minuti. Conservare la soluzione a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
NOTA: Ci sono tre diverse opzioni per la spruzzatura della matrice: utilizzando un aerografo, uno spruzzatore a ultrasuoni o uno spruzzatore automatico.
- Spruzzare la matrice con un aerografo
- Eseguire l'operazione a temperatura ambiente (20–23 °C) e umidità (40%–60%) costanti. I parametri da regolare per una spruzzatura ottimale includono la dimensione della gocciolina, la quantità di nebbia, l'angolo e la distanza tra l'ugello di spruzzatura e la sezione di tessuto e la temperatura e l'umidità del laboratorio. Regolare queste condizioni controllando i risultati della microscopia.
nota: Poiché i fattori limitanti includono la dimensione del cristallo e l'omogeneità della copertura della matrice e la migrazione/diffusione indesiderata degli analiti, una dimensione più piccola è migliore per la dimensione della goccia. L'omogeneità è anche il punto di controllo.
- Spruzzatura della matrice con uno spruzzatore a ultrasuoni
- Rimuovere il fazzoletto da spruzzare dall'essiccatore e posizionarlo nella camera. Assicurarsi che il fazzoletto non copra la finestra del sensore.
- Iniziare la preparazione premendo il pulsante Start; di solito, il tempo di preparazione è di circa 90 minuti. La preparazione sarà regolata automaticamente tramite il monitoraggio dello spessore dello strato di matrice e dell'umidità. Al termine della preparazione, rimuovere il vetrino e conservarlo nell'essiccatore per 15 minuti prima di leggerlo nello strumento MALDI.
- Pulire lo spruzzatore con 2-3 ml di metanolo al 100% (MeOH) fino a quando la testina di spruzzatura non appare pulita.
nota: Una sottile nebbia di goccioline di matrice viene lasciata penetrare nel tessuto da un foglio gravitazionale. Viene generata una dimensione media delle gocce di 20 μm; Tutti i diametri delle gocce sono inferiori a 50 μm.
- Spruzzatura della matrice con uno spruzzatore automatico
- Spruzzare la soluzione della matrice sulla superficie del tessuto con uno spruzzatore automatico. Un flusso costante di gas di guaina riscaldata (N2, impostato a 10 psi e 75 °C) verrà erogato insieme alla soluzione spray della matrice. Utilizzare un sistema di pompaggio del solvente (impostato a 10 psi e 0,15 mL/min) per erogare la soluzione della matrice.
nota: Soprattutto, lavora sotto una cabina di sicurezza per evitare qualsiasi inalazione di aerosol a matrice. Controllare la temperatura e l'umidità dell'ambiente per riprodurre la cristallizzazione omogenea della matrice.
2. MALDI-IMS
- Esegui la spettrometria di massa ad altissima velocità.
- Esegui esperimenti di imaging ad alta produttività e ad alta risoluzione spaziale con MALDI-IMS dotato di un laser a granato di ittrio e alluminio drogato al neodimio (Nd:YAG, 355 nm) a 10 kHz.
- Per le misure di spettrometria di massa, definire le aree tissutali utilizzando il software di controllo MALDI e il software di analisi dei dati.
- Acquisisci spettri in modalità lineare positiva con un intervallo di massa di m/z 2.000-20.000 e una risoluzione spaziale di 20 e 100 μm.
- Per creare lo standard di calibrazione, sciogliere lo standard di calibrazione dei peptidi e lo standard di calibrazione delle proteine con un rapporto di 1:4 con acido alfa-ciano-4-idrossil-cinnamico (CHCA) in una soluzione di TA30 (ACN:0,1% TFA = 30:70) e quindi diluirlo 10 volte. Posizionare 1 μL di standard di calibrazione sul vetrino in quattro posizioni diverse.
- Utilizzando un software di istologia molecolare (vedi Tabella dei materiali), sovrapponi più immagini singole per trovare la correlazione spaziale di vari segnali, come diversi peptidi Aβ che colocalizzano nelle placche senili (SP) e nelle pareti arteriose.
