Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Materiali
- Preparazione dell'iniezione di lipopolisaccaride (LPS)
- Aggiungere 25 mL di acqua distillata a 25 mg di polvere di LPS derivata da Salmonella typhimurium a una concentrazione finale di 1 mg/mL. Conservare l'iniezione in una provetta sterile a 4 °C.
cautela: L'LPS è tossico.
- Preparare una soluzione di blu di Evans (EB) al 2% in una normale soluzione salina allo 0,9% per mantenere l'iniezione di EB alla concentrazione di lavoro.
2. Animali
Somministrare LPS a ratti maschi di Sprague-Dawley (SD), di età pari a 10 settimane (peso medio: 280 ± 20 g) mediante iniezione intraperitoneale.
cautela: Se i ratti vengono acquistati da un'altra organizzazione, la fase di adattamento non dovrebbe essere inferiore a 7 giorni.
3. Iniezioni LPS
- Iniettare LPS per via intraperitoneale in ciascun ratto alla dose di 1 mg/kg e riportare i ratti nella loro gabbia di casa.
nota: L'anestesia non è necessaria.
- Sei ore dopo, iniettare la stessa dose di iniezione di LPS nei ratti.
- Sedici ore dopo iniettare la stessa dose di LPS nei ratti.
cautela: L'iniezione di LPS nei ratti SD alla dose di 1 mg/kg può comportare un tasso di mortalità del 5%. Il tasso di mortalità potrebbe aumentare ulteriormente nei ratti più giovani o più anziani o nelle femmine di ratto gravide.
- Riportare i ratti nelle loro gabbie dopo l'iniezione di LPS e fornire l'accesso ad libitum a cibo e bevande.
nota: I ratti mostreranno una distinta risposta infiammatoria sistemica, e quindi è essenziale che le gabbie rimangano pulite durante l'esperimento. I ratti devono essere monitorati frequentemente (2 volte al giorno) per il peso, l'aspetto generale e l'atteggiamento dopo la prima iniezione di LPS. Se i ratti iniziano a mostrare una postura curva, riluttanza a muoversi, significativa perdita di peso (>20%), colorazione con porfirina, devono essere soppressi umanamente prima del punto finale dello studio EB di 7 giorni.
4. Raccolta di campioni
- Iniezione EB
- Sette giorni dopo la prima iniezione, anestetizzare il ratto per via intraperitoneale secondo il protocollo IACUC approvato.
- Attendere 1-2 minuti fino a quando i ratti non mostrano risposte riflesse corneali. Eseguire una puntura cardiaca profonda 5-8 mm su ciascun ratto; Il punto di perforazione dovrebbe trovarsi a 5 mm dal margine sinistro dello sterno al 3° e 4° spazio intercostale.
- Attendere fino a quando non si osserva il recupero del sangue, quindi iniettare EB alla dose di 0,2 ml/100 g di peso corporeo nel ventricolo cardiaco sinistro.
cautela: La puntura cardiaca e l'iniezione di EB devono essere eseguite con attenzione. L'EB può essere iniettato nella cavità toracica o nel pericardio invece che nel ventricolo cardiaco sinistro.
- Risucchiare con un tubo vuoto e sostituire questo volume con un tubo EB prima dell'iniezione per ridurre il tasso di guasto (ad esempio, iniezione nella gabbia toracica per errore).
- Tenere il ratto in posizione supina per 10 min.
NOTA: Se il campione non viene utilizzato per rilevare la perdita di EB nell'imaging in immunofluorescenza, questo passaggio può essere omesso.
- Osservazione grossolana
- Eseguire perfusioni cardiache utilizzando soluzione salina tampone fosfato 1 M (PBS) ghiacciato per liberare la vascolarizzazione cerebrale e il cervello.
- Usando un bisturi, praticare un'incisione addominale su tutta la lunghezza del diaframma.
- Taglia le costole appena a sinistra della linea mediana della gabbia toracica.
- Aprire la cavità toracica. Utilizzare i morsetti per esporre il cuore e facilitare il drenaggio del sangue e di altri liquidi.
- Tenendo saldamente il cuore con una pinza (il cuore dovrebbe ancora battere), inserire direttamente un ago nella sporgenza del ventricolo sinistro per estenderlo a circa 5 mm. Fissare l'ago in quella posizione bloccandolo vicino al punto di entrata.
cautela: Non estendere eccessivamente l'ago, in quanto può perforare la parete interna e compromettere la circolazione delle soluzioni.
- Rilasciare la valvola per consentire il flusso della soluzione PBS ghiacciata (200-300 ml) a una velocità lenta e costante a circa 20 ml/min utilizzando una pompa di perfusione. Se gli animali richiedono una fissazione invece di un'osservazione grossolana, utilizzare la stessa dose di soluzione salina ghiacciata allo 0,9%.
- Usando delle forbici affilate, praticare un'incisione nell'atrio, assicurandosi che la soluzione scorra continuamente. Se il fluido non scorre liberamente o proviene dalle narici o dalla bocca dell'animale, riposizionare l'ago.
- Screening per CMH mediante osservazione macroscopica.
nota: Se il campione non viene utilizzato nel calcolo del numero di CMH mediante osservazione macroscopica, questo passaggio può essere omesso.
- fissazione
- Eseguire perfusioni cardiache utilizzando una soluzione salina ghiacciata allo 0,9% (200-300 ml) per liberare la vascolarizzazione cerebrale e il cervello.
- Eseguire perfusioni cardiache utilizzando paraformaldeide ghiacciata al 4% per la fissazione.
- Decapitare il ratto, isolare il cervello e immergere il cervello in una soluzione di saccarosio al 20% per almeno 6 ore.
- Cambiare la soluzione in saccarosio al 30% e fissare per altre 6 ore.
- Preparare sezioni di tessuto cerebrale di 10 mm di spessore utilizzando un criostato.
5. Colorazione con ematossilina ed eosina (HE)
NOTA: Questa procedura viene eseguita utilizzando un kit di colorazione HE.
- Lavare i vetrini in acqua distillata.
- Colorare in soluzione di ematossilina per 8 min. Lavare in acqua corrente per 5 min.
- Differenziare in alcool acido all'1% per 30 s. Lavare in acqua corrente per 1 min.
- Colorare in acqua di ammoniaca allo 0,2% (Bluing) o in una soluzione satura di carbonato di litio per 30 s a 1 min. Lavare in acqua corrente per 5 min.
- Sciacquare con alcool al 95% (10 immersioni).
- Controcolorare con soluzione di eosina per 30 s a 1 min.
- Disidratare con alcol al 95%, due cambi di alcol assoluto, per 5 min ciascuno.
- Chiarificare in xilene per 30 s.
- Monta usando il metodo di Liu.
- Analisi con un microscopio a fluorescenza in campo chiaro.
nota: I globuli rossi rilasciati dai vasi sanguigni, che sono i componenti dei CMH, appaiono in rosso-arancio sotto la colorazione HE.
