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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Coltura cellulare ippocampale primaria
- Preparare la coltura cellulare dissociata dell'ippocampo di ratto il giorno 19 embrionale. Piastra le cellule su vetrini coprioggetti da 12 mm rivestiti con polietilenimmina (PEI) in piastre a 24 pozzetti a una densità di 50.000 - 60.000 cellule/pozzetto. Controllare la densità utilizzando una camera di conteggio delle cellule e un'ottica a contrasto di fase.
- Coltura dei neuroni per 3 giorni (giorno in vitro (DIV) 3) in una piastra a 24 pozzetti nell'incubatore a 37 °C con CO2 al 5%.
- Valutare i vetrini coprioggetti per gli indicatori di salute delle cellule utilizzando la microscopia a luce trasmessa (ad esempio, ottiche a contrasto di fase con un ingrandimento di 10 - 20X). Verificare la presenza dei seguenti indicatori di buona salute: un chiaro alone di contrasto di fase, neuriti senza strutture perline e nessun raggruppamento di soma o neuriti.
2. Trasfezione
NOTA: Il seguente protocollo si riferisce a una doppia trasfezione per 3 pozzi. Tuttavia, il protocollo funziona meglio quando vengono preparate quantità sufficienti per 4 pozzetti.
- Preparare 500 mL di tampone di trasfezione (274 mM di cloruro di sodio, NaCl, 10 mM di cloruro di potassio, KCl, 1,4 mM di idrogeno fosfato, Na2HPO4, 15 mM di glucosio, 42 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico, HEPES) in un pallone di Erlenmeyer.
- Sciogliere 8,0 g di NaCl, 0,37 g di KCl, 0,095 g di Na2HPO4, 1,35 g di glucosio e 5,0 g di HEPES in 400 ml di acqua distillata in un matraccio di Erlenmeyer.
- Regolare il pH a 6,95 con 1 M di idrossido di sodio, NaOH utilizzando un pHmetro.
- Regolare il volume con acqua distillata a 500 ml e controllare il pH utilizzando un pHmetro.
- Prelevare aliquote da 20 a 30 mL di tampone di trasfezione con i seguenti valori di pH pipettando 1 M di NaOH nel tampone di trasfezione: 6,96, 6,97, 6,98, 6,99, 7,00, 7,01, 7,02, 7,03, 7,04, 7,05, 7,06, 7,07, 7,08, 7,09, 7,11.
NOTA: Il pH del tampone di trasfezione è fondamentale per l'efficacia della trasfezione.
- Per verificare quale tampone di trasfezione porta al maggior numero di cellule trasfettate, testare ciascun valore di pH da 6,96 a 7,11. Utilizzare il metodo di trasfezione descritto in 2.2 - 2.11 e un plasmide convalidato che esprime la proteina fluorescente verde (GFP). Determinare il numero di cellule trasfettate per vetrino coprioggetto per ogni valore di pH del tampone di trasfezione per valutare quale tampone funziona meglio.
- Aliquotare il tampone con la massima efficienza di trasfezione in provette per microcentrifuga da 2 mL Congelare e conservare le provette a -20 °C.
- Preriscaldare il terreno di siero, il terreno di coltura cellulare e l'acqua distillata a 37 °C nel bagnomaria.
- Preparare la miscela di trasfezione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Lavorare sotto la cappa a flusso laminare per garantire condizioni di lavoro sterili.
- Mescolare 7,5 μl di cloruro di calcio 2 M con 4 μg di DNA privo di endotossine (Synaptophysin-mOrange e mGFP/GFP-Rogdi). Aggiungere acqua per raggiungere un volume totale di 60 μl in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 60 μl di tampone di trasfezione alla miscela. Per ottenere i migliori risultati, aggiungere il tampone di trasfezione goccia a goccia agitando delicatamente la miscela di DNA sul vortice.
- Incubare a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti. Evitare di scuotere la provetta di incubazione durante il tempo di incubazione posizionando la provetta vicino alla cappa a flusso laminare.
- Sotto la cappa a flusso laminare, rimuovere il terreno di coltura cellulare ("terreno condizionato") dai pozzetti utilizzando una pipetta da 1000 μl e conservarlo in un contenitore separato nell'incubatore.
- Aggiungere 500 μl di terreno sierico ridotto in ciascun pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 fino al termine del periodo di incubazione di 20 minuti (fase 2.3.3).
- Aggiungere 30 μl di miscela di trasfezione a ciascun pozzetto pipettando diverse gocce. Eliminare i residui sul fondo del tubo.
- Dopo che tutti i pozzetti sono stati alimentati con la miscela di trasfezione, agitare delicatamente la piastra a 24 pozzetti per garantire la distribuzione della miscela di trasfezione nel terreno.
- Incubare i pozzetti per 60 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Rimuovere ed eliminare la miscela di trasfezione e lavarla tre volte con terreno di coltura cellulare. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto e incubarli per 30 secondi a RT. Rimuovere 750 μL di terreno e aggiungere la stessa quantità di terreno fresco. Ripeti l'operazione tre volte.
NOTA: La fase di lavaggio è fondamentale. Mantenere al minimo il tempo in cui ogni pozzetto non ha mezzo (ad esempio, rimuovere e sostituire pozzetto per pozzetto) e aggiungere delicatamente il mezzo di lavaggio.
- Rimuovere e scartare il terreno di coltura cellulare e aggiungere 450 μl del terreno condizionato pozzetto per pozzetto.
- Lasciare maturare i neuroni nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 a DIV 10.
3. Stimolazione e assorbimento di Syt1
NOTA: Il seguente protocollo applica l'assorbimento a 3 pozzi. Per la depolarizzazione di qualsiasi altro numero di pozzetti, regolare le quantità di conseguenza.
- Preparare 50 mL di tampone di depolarizzazione 10x (640 mM NaCl, 700 mM KCl, 10 mM cloruro di magnesio, MgCl2, 20 mM cloruro di calcio, CaCl2, 300 mM di glucosio, 200 mM HEPES, pH 7,4) in un pallone di Erlenmeyer.
NOTA: Il tampone di depolarizzazione può essere mantenuto a 4 °C per diverse settimane. Se si utilizza anche una soluzione non depolarizzante, preparare una soluzione di Tyrode 10x composta da 1290 mM di NaCl, 50 mM di KCl, 10 mM di MgCl2, 20 mM di CaCl2, 300 mM di glucosio, 200 mM di HEPES pH 7,4 per confrontare il riciclo indotto dalla stimolazione con il riciclo spontaneo. Dopo la diluizione a 1x, aggiungere 1 μM di tetrodotossina prima dell'uso per bloccare la generazione del potenziale d'azione.
- Sciogliere 1,87 g di NaCl, 2,61 g di KCl, 0,1 g di MgCl2-6H 2O, 0,15 g di CaCl 2-2H2O e 3,0 g di glucosio-1 H2O e 2,38 g di HEPES in 50 ml di acqua distillata in un pallone di Erlenmeyer. Regolare il pH con NaOH e filtrare sterile-la soluzione. Diluire il tampone 1:10 in acqua distillata per ottenere una concentrazione 1x.
- Preparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,4) per il fissaggio dopo la stimolazione.
- Per 500 mL di PFA al 4% in 1x PBS, sciogliere 20 g di paraformaldeide in 450 mL di H2O.
NOTA: Il riscaldamento della soluzione può accelerare la dissoluzione, ma non riscaldare la soluzione oltre i 70 °C, poiché il PFA potrebbe disintegrarsi.
cautela: Il PFA è tossico, potenzialmente cancerogeno e teratogeno. Indossare i guanti quando si lavora con il PFA, lavorare sotto la cappa aspirante ed evitare l'ingestione.
- Lasciare raffreddare la soluzione a RT e aggiungere 50 ml di soluzione madre PBS 10x. Regolare il pH a 7,4 con NaOH/HCl (acido cloridrico) utilizzando un pHmetro.
- Preriscaldare 600 μL di 1x tampone di depolarizzazione e 10 mL di terreno di coltura cellulare a 37 °C in bagnomaria.
- Aggiungere 1 μL di anticorpo di topo anti-Syt1 (clone 604.2) al tampone di depolarizzazione 1x e vorticare per 10 secondi.
- Rimuovere ed eliminare il terreno di coltura cellulare dalle cellule. Aggiungere 200 μl della miscela di anticorpi depolarizzanti in ciascun pozzetto e incubare per 5 minuti a 37 °C e 5% di CO2 nell'incubatore.
- Rimuovere ed eliminare la miscela di anticorpi depolarizzanti e lavarla tre volte con terreno di coltura cellulare. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto e incubare per 30 secondi a RT. Rimuovere 750 μL di terreno e aggiungere la stessa quantità di terreno fresco. Ripeti tre volte.
- Rimuovere ed eliminare il terreno di coltura cellulare e aggiungere 300 μl di PFA al 4% in 1x PBS. Incubare per 20 minuti a 4 °C.
- Lavare tre volte per 5 minuti ciascuna con 1x PBS.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
4. Immunocitochimica
- Preparare 50 ml di tampone bloccante.
NOTA: Il tampone di blocco può essere mantenuto a -20 °C per diversi mesi.
- Sciogliere 2,5 g di saccarosio e 1 g di albumina sierica bovina (BSA) in 5 mL di soluzione madre 10x PBS. Aggiungere 1,5 ml di soluzione madre detergente al 10%. Mescolare la soluzione fino a quando tutti i componenti non si sono adeguatamente sciolti e aggiungere H2O distillato fino a raggiungere un volume finale di 50 mL. Aliquotare la soluzione e congelare le aliquote per la conservazione.
- Diluire l'anticorpo secondario accoppiato al fluoroforo (diretto contro la specie primaria di anticorpi Syt1) in 200 μL di tampone bloccante in ciascun pozzetto a una diluizione di 1:1000.
- Rimuovere e scartare il PBS 1x da ogni pozzetto contenente un vetrino coprioggetti.
- Aggiungere 200 μl di miscela tampone-anticorpo bloccante a ciascun pozzetto e incubare per 60 minuti a RT.
cautela: Poiché gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce, tutti i passaggi che vanno avanti devono essere eseguiti al buio.
- Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte per 5 minuti con 1 mL di 1x PBS.
- Incorporare i vetrini coprioggetti sui vetrini del microscopio con il mezzo di inclusione.
- Aggiungere una goccia di 7 μl di terreno di inclusione sul vetrino del microscopio. Rimuovere il vetrino coprioggetti dalla piastra a 24 pozzetti sollevandolo con una siringa e afferrandolo con una pinza.
cautela: Le cellule sulla superficie del vetrino coprioggetti si danneggiano facilmente, quindi le pinze devono essere maneggiate con cura.
- Immergere il vetrino coprioggetti in acqua distillata per rimuovere il PBS e asciugarlo accuratamente toccando un bordo del tessuto molle.
- Capovolgere il vetrino coprioggetti sulla gocciolina del terreno di inclusione, in modo che la superficie che trasporta le cellule sia rivolta verso il vetrino del microscopio, incorporando così le cellule nel mezzo di inclusione.
- Lasciare asciugare i vetrini sotto la cappa per 1 - 2 ore (coprirli per evitare l'esposizione alla luce) e conservarli in una scatola per vetrini da microscopio a 4 °C.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.