1. Trattamento dei neuroni
Nota: Il trattamento è stato eseguito presso la Divisione (DIV) 7. Tutte le fasi vengono eseguite sotto una cappa di coltura cellulare in condizioni sterili. Un esempio di densità di coltura neuronale corticale a DIV 7 è illustrato nella Figura 1.
- Aggregati αS associati a microsomi ottenuti dal midollo spinale di tre diversi topi transgenici malati per avere una soluzione di 1 μg/μL, utilizzando il tampone di omogeneizzazione originale [composto da 250 mM di saccarosio, 20 mM di HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanasolfonico), 10 mM di KCl (cloruro di potassio), 1,5 mM di MgCl2 (cloruro di magnesio), 2 mM di EDTA (acido etilendiamminotetraacetico), e 1x inibitori della fosfatasi/proteasi] per la diluizione.
- Effettuare una coltura neuronale su vetrini coprioggetti di poli-D-lisina in piastre a 24 pozzetti contenenti terreno (2% di B27, 10x gentamicina e 2 mM di glutammina). Rimuovere 1/3 del terreno e sostituirlo delicatamente con il terreno fresco contenente il 2% di B27, 1x gentamicina e 2 mM di glutammina.
- Aggiungere 1 μg di aggregati di alfa-sinucleina (αS) associati a microsomi aggregati al terreno cellulare. Riportare i neuroni nell'incubatore a 37 °C.
- Ogni 3 giorni per 1 settimana, aggiungere 1/3 di terreno fresco. Non sostituire il supporto. Basta aggiungerlo.
- Dopo 1 settimana di trattamento, rimuovere 1/3 del terreno e sostituirlo delicatamente con il terreno fresco contenente il 2% di B27, 10 μg/mL di gentamicina e 2 mM di glutammina. Ripetere ogni 3 giorni.
- Fissare i neuroni dopo 2 settimane di trattamento (DIV 21).
2. Immunofluorescenza
- Fissare i neuroni con paraformaldeide al 2% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x e soluzione di saccarosio al 5% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) senza agitare sotto una cappa chimica.
- Rimuovere la soluzione fissante. Lavare brevemente con PBS 1x, 3 volte.
nota: Eseguire delicatamente tutte le fasi di lavaggio perché i neuroni primari non si attaccano saldamente ai vetrini coprioggetti in polilisina.
- Permeabilizzare i neuroni con lo 0,3% di tensioattivo non ionico in PBS 1x per 5 minuti a RT.
- Lavare brevemente con PBS 1x, 3 volte.
- Incubare i neuroni con il 3% di siero fetale bovino (FBS) in PBS 1x per 30 minuti a RT per bloccare i siti di legame non specifici su uno shaker orbitale.
- Incubare i neuroni con un anticorpo primario appropriato disciolto in FBS al 3% in PBS 1x, O/N a 4 °C su un agitatore orbitale.
NOTA: sono stati utilizzati gli anticorpi syn303 (1:1.000), αS di topo (1:200), pser129-αS (1:1.000) e Tau (1:10.000).
- Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare, brevemente, con PBS 1x, 3 volte.
- Incubare i neuroni con un anticorpo secondario fluorescente appropriato disciolto in FBS al 3% in PBS per 1 ora a RT al buio su uno shaker orbitale.
- Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare, brevemente, con PBS 1x, 3 volte.
- Colorare i neuroni con una soluzione DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) (0,1 μg/mL in PBS 1x) per 15 minuti a RT al buio su un agitatore orbitale.
- Rimuovere la soluzione anticorpale e lavare, brevemente, con PBS 1x, 3 volte.
- Montare i vetrini coprioggetti su un vetrino utilizzando un mezzo di montaggio antisbiadimento.
