Un modello in vitro di lesione da stiramento in neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Abstract

Fonte: Phillips, J. K. et al. Metodo per la lesione da stiramento ad alta velocità di neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane in un formato a 96 pozzetti. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video dimostra il processo di induzione della lesione da stiramento su neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCN). Le cellule vengono prelevate in una piastra multipozzetto senza fondo con una membrana di silicone attaccata. Lo stress meccanico controllato viene applicato sulla membrana per indurre l'interruzione del citoscheletro e il danno alla membrana cellulare, inducendo un fenotipo di lesione da stiramento nelle cellule.

Protocollo

1. Fabbricazione di piastre

1. Trattare al plasma una piastra da 96 pozzetti con un pulitore al plasma da 200 W (vedere la Tabella dei materiali) per 60 secondi ad alta potenza, posizionandola con il lato inferiore rivolto verso l'alto all'interno del pulitore al plasma. Verificare la presenza di un bagliore viola visibile attraverso la finestra della camera, che indica che si è formato un plasma efficace. Questa tecnica di legame è adattata da Sunkara et al.
2. Entro 60 s, immergere la parte superiore della piastra in 200 ml di trietossisilano all'1,5% (3-amminopropil) (APTES) in acqua deionizzata (DI) per 20 minuti, con il lato inferiore rivolto verso il basso. Questa soluzione è instabile: prepararla non più di 60 s prima di introdurre la piastra.
   cautela: Lavora con APTES in una cappa aspirante.
3. Il plasma tratta una membrana di silicone estratta nel pulitore al plasma per 60 secondi ad alta potenza. Programmare il trattamento al plasma in modo che termini non più di 5 minuti prima della fine del periodo di 20 minuti nella fase 1.2.
4. Utilizzare una pinza per posizionare la membrana trattata al plasma sopra un rettangolo di carta pergamena di 7,5 x 11 cm². Allineare una lastra di alluminio di 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm sulla parte inferiore del morsetto di fabbricazione della piastra. Allineare la membrana siliconica e la carta da forno sulla lastra di alluminio utilizzando una pinza.
5. Rimuovere le parti superiori delle piastre dal bagno APTES e scrollarsi di dosso la soluzione in eccesso. Immergere in un bagnomaria da 200 ml di deionizzata per 5 s e scrollarsi di dosso l'acqua in eccesso. Immergere in un altro bagnomaria da 200 ml di DI per 5 s e scrollarsi di dosso l'acqua in eccesso. Sostituire l'acqua in questi bagni prima di immergere un altro piano di piastra.
6. Utilizzare aria compressa per asciugare completamente la parte superiore della piastra.
7. Posizionare la parte superiore della piastra nella parte superiore del morsetto di fabbricazione della piastra. Chiudere delicatamente il morsetto di fabbricazione della piastra per premere insieme la parte superiore della piastra e il silicone. Clamp per almeno 1 h.
8. Lasciare indurire la piastra per 24 ore a temperatura ambiente prima dell'uso, al riparo dalla polvere.

2. Allungare un piatto

1. Pulire i penetratori
   1. Preparare un sonicatore a bagno da 60 W con acqua deionizzata a temperatura ambiente.
   2. Sostenere il blocco penetratore sopra il bagno del sonicatore, capovolto in modo che solo la parte superiore dei penetratori sia immersa a una profondità di almeno 1 mm. Sonicare i penetratori per 8 minuti a 42 kHz.
   3. Asciugare i penetratori con aria compressa.
2. Allineare il blocco del penetratore
   1. Posizionare una telecamera con un feed live sopra il dispositivo di allungamento in modo che guardi verso il basso sull'array di penetratori. Concentrati sulla parte superiore dei penetratori.
      nota: La configurazione descritta nella Sezione 3, "Caratterizzazione dell'allungamento della membrana", è una possibile configurazione della telecamera per questo compito.
   2. Fissare una piastra sul tavolino del dispositivo per lesioni utilizzando il tavolino clamps (Figura 1) e posizionare una luce a cupola sopra il dispositivo.
      nota: Vedere la tabella dei materiali per il software di controllo dello strumento.
   3. Avviare il software di controllo dello strumento facendo clic sull'icona del software sul desktop del computer che controlla il dispositivo di lesione. Esegui il progetto "in_vitro_neurotrauma.lvproj" facendo clic su di esso nella finestra di avvio. Dalla finestra del progetto, avviare gli strumenti virtuali (VI) per il controllo del movimento e l'inseguitore della posizione, denominati rispettivamente 'motion_control.vi' e 'position_tracker.vi', facendo doppio clic su di essi.
   4. Chiudere la gabbia che circonda il dispositivo per lesioni. Premi il pulsante "freccia" nell'angolo in alto a sinistra del VI di controllo del movimento per eseguire il VI e fai clic su "Near Bottom" per abbassare il tavolino entro 2 mm dal contatto con i penetratori. Fare clic sul pulsante 'Stop' per arrestare il VI.
      cautela: Tenere le mani lontane dalla barella quando si manipola la telecamera nella gabbia. La gabbia deve essere dotata di un interruttore della porta che fornisca alimentazione al dispositivo di allungamento solo quando la porta della gabbia è chiusa.
   5. Nella finestra del progetto, fare clic con il pulsante destro del mouse su "Asse 1". Fare clic su "Pannello di test interattivo". Nella finestra che si apre, impostare la dimensione del passo su 50 μm inserendo "500" unità nel campo "Posizione target".
   6. Fare clic ripetutamente sul pulsante verde "Vai" nella parte inferiore della finestra "Pannello di test interattivo" fino a quando la piastra non entra in contatto per la prima volta con i penetratori. Verificare la presenza di contatti nell'immagine dal vivo visualizzata dalla telecamera. Notare la posizione verticale dello stadio riportata in alto a sinistra nella finestra 'Interactive Test Panel'; Questa è la prima posizione di contatto.
   7. Abbassare ulteriormente (come descritto al punto 2.2.6) fino a quando ogni pozzo non è entrato in contatto con i penetratori. Se necessario, spostare la telecamera per vedere l'intera lastra e spostare il tavolino verso l'alto (specificando una "Posizione target" negativa) e verso il basso. Notare la posizione verticale del palco riportata in alto a sinistra della finestra quando tutti i montanti sono a contatto (questa è la posizione di contatto completo).
   8. Notare la differenza tra la posizione del primo contatto e quella del contatto completo. Chiudere il 'Pannello di test interattivo'. Esegui il 'Motion Control VI' (vedi passaggio 2.2.4) e fai clic su 'Top' per sollevare il palco. Arrestare il controllo del movimento VI con il pulsante 'Stop'.
   9. Una volta che il palco è al massimo della sua corsa, apri la porta per disattivare il dispositivo. Regolare le viti di fermo sugli angoli del blocco penetratore. Allentare la vite di fermo sull'angolo che è entrato in contatto per primo, per abbassarla e serrare la vite opposta per sollevare l'angolo che ha fatto contatto per ultimo.
   10. Ripetere il processo di abbassamento del tavolino fino a quando la piastra non tocca i penetratori, ispezionare le immagini di contatto per verificare l'inclinazione, sollevare il tavolino e regolare (passaggio 2.2.9) il blocco del penetratore. Quando il tavolino e il blocco sono allineati, tutti i penetratori entreranno in contatto contemporaneamente.
   11. Aprire lo sportello per disattivare il dispositivo. Inserire le viti di fissaggio nei fori del blocco penetratore e serrarle. Verificare che il blocco sia a livello con le viti di fissaggio in posizione (passaggi 2.2.4-2.2.8). Prendere nota della posizione del tavolino riportata dal "Pannello di prova interattivo" quando la piastra entra in contatto. Questa sarà la posizione zero per gli esperimenti di indentazione.
3. Lubrificare i penetratori
   1. Se il blocco penetratore è stato appena installato e non è ancora stato lubrificato, pulire un tampone di gomma solida (7,5 cm x 11 cm x 1,5 mm) e un tampone di gommapiuma morbida a cellule chiuse (7,5 cm x 11 cm x 3 mm) con una salvietta da laboratorio imbevuta di etanolo. Lasciali asciugare all'aria.
   2. Immergi una salvietta da laboratorio nell'olio di mais e stendila sul tampone di gomma solida fino a farla brillare.
   3. Posizionare il tampone di schiuma sul tampone di gomma solida per trasferire l'olio sul tampone di schiuma. Posizionare una lastra di alluminio di 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm sopra il cuscinetto di schiuma e caricarla con un peso di zavorra di circa 360 g (ad esempio, 6 tubi conici caricati con 45 ml di acqua ciascuno) per garantire un trasferimento costante dell'olio dal cuscinetto di gomma piena al cuscinetto di schiuma. Attendere 10 s affinché l'olio si trasferisca sul tampone di gommapiuma.
   4. Spostare il tampone di gommapiuma sull'array del penetratore. Posizionare la lastra di alluminio e il peso della zavorra sopra di essa per garantire un trasferimento costante dell'olio alle punte dei penetratori. Attendere 10 s affinché l'olio si trasferisca ai penetratori.
   5. Se nessuna piastra è stata allungata da quando il blocco penetratore è stato installato e lubrificato per la prima volta, allungare una piastra di prova prima di iniziare l'esperimento. Nota: questo eviterà che qualsiasi incoerenza tra il primo tratto e i tratti successivi possa confondere l'esperimento. Per gli allungamenti successivi, ripetere solo i passaggi 2.3.2-2.3.5 prima di ogni allungamento.
4. Allungare un piatto
   1. Lubrificare i penetratori come descritto al punto 2.3.
   2. Fissare la piastra sul tavolino del dispositivo di lesione con il tavolino clamps. Se è necessaria la sterilità, regolare la posizione del coperchio per fissare la piastra senza esporre la superficie di coltura all'aria ambiente.
   3. Abbassare il tavolino in posizione zero utilizzando il 'controllo del movimento VI' (vedere i passaggi 2.2.4-2.2.6); la posizione zero viene determinata durante il passaggio 2.2.
   4. Cambia il nome del file nel campo "percorso file" nel 'VI di tracciamento della posizione' con un nome di file univoco, quindi eseguilo con il pulsante 'freccia' nell'angolo in alto a sinistra di quella finestra.
   5. Impostare la profondità e la durata dell'impronta (tipicamente 1-4 mm e 30 ms, rispettivamente, profondità massima 5 mm, durata minima 15 ms) nei campi 'Infortunio (mm)' e 'Durata infortunio (ms)' nel 'pannello di controllo movimento VI' facendo clic sui campi e digitando i valori desiderati.
   6. Esegui il 'pannello di controllo del movimento VI' e fai clic su 'Ferisci' per far rientrare la piastra.
   7. Sposta il livello fino alla parte superiore della sua corsa facendo clic su "Top". Quindi arrestare il VI con il pulsante "Stop" e disattivare il dispositivo di lesione aprendo la porta.
   8. Ispezionare la cronologia degli spostamenti dello stadio presentata nel 'position tracker VI' per confermare che sia stato applicato lo spostamento massimo specificato. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico e fare clic su "esporta in Excel". Clicca su 'File| Salva' per salvare i dati.

3. Caratterizzazione dell'allungamento della membrana

1. Dipingi di bianco l'incavo nella parte superiore di ciascun penetratore per fornire uno sfondo ad alto contrasto per la videografia ad alta velocità. Attenzione: Non verniciare i bordi dei penetratori dove entrano in contatto con le piastre.
2. Stampa in 3D con acido polilattico (PLA), o altrimenti fabbrica, un timbro cilindrico con cui creare un punto in ogni pozzetto. Realizzare il cilindro di 5,9 mm di diametro e 12,2 mm di altezza, con una sporgenza cilindrica di 1,5 mm di diametro e 1,0 mm di altezza centrata sulla parte superiore.
3. Il plasma tratta la piastra con il lato destro rivolto verso l'alto per attivare la superficie di coltura cellulare in silicone nei pozzetti per 60 s, come indicato nella fase 2.1.
4. Posizionare la piastra su un cuscinetto di gomma o su un'altra superficie morbida. Adescare la piccola sporgenza sul timbro (vedere il passaggio 1.2) con l'inchiostro di un pennarello indelebile. Inserire il timbro nel pozzetto da testare e picchiettare per garantire un buon trasferimento dell'inchiostro. Adescare il timbro prima di ogni pozzo.
5. Allineare il blocco del penetratore e lubrificare i penetratori del dispositivo di lesione (vedere i passaggi 2.2-2.3). Fissare la piastra sul tavolino del dispositivo di lesione. Posizionare una luce assiale diffusa e brillante sopra il dispositivo di lesione.
6. Posiziona una telecamera ad alta velocità su un supporto a braccio sopra il dispositivo per lesioni, rivolta verso il basso, con l'obiettivo impostato sul numero f-stop più piccolo, e accendila. Avviare il software della fotocamera sul computer collegato alla fotocamera. Nel menu a discesa Frequenza fotogrammi, selezionare 2.000 fotogrammi al secondo e nel menu a discesa dell'otturatore, selezionare il tempo di esposizione più veloce che produce immagini ad alto contrasto. Centra i pozzetti punteggiati.
   1. Posizionare la telecamera in modo che il campo visivo contenga 12 pozzetti in una griglia 3 x 4.
      nota: Questo campo visivo offre un compromesso ottimale tra produttività e risoluzione per un'immagine da 1.280 × 1.024.
7. Abbassare la piastra fino al punto zero (vedere i passaggi 2.2.4-2.2.6). Fare clic con un clic sul pulsante di registrazione sul software della fotocamera in modo che venga visualizzato "trigger in". Avvia il tracciatore di posizione VI (passaggio 2.4.4).
8. Attiva la luce assiale diffusa e intensa. Far rientrare la piastra come descritto al punto 2.4.6.
9. Spegnere la luce assiale diffusa e intensa.
10. Sul computer di controllo della telecamera, trova la finestra di 30-40 ms della registrazione in cui si verifica l'indentazione: trascina le frecce di inizio e fine nella barra di riproduzione video ad alta velocità nel software della fotocamera. Fai clic su Salva, imposta il nome nel campo "Nome file", seleziona "TIFF" nel campo "Formato" e fai clic su "Salva".
    1. Esaminare il file . File TIF per le immagini degli stati meno allungati (inizio) e più allungati (picco di indentazione).
    2. Per misurare l'altezza e la larghezza dei punti in entrambe le immagini, utilizzare Fiji per aprire le immagini del tratto minimo e del picco fianco a fianco. Utilizzando lo strumento di selezione rettangolare predefinito, fare clic e trascinare per disegnare una casella attorno a un punto nell'immagine meno allungata. Misura l'altezza e la larghezza con 'Analizza| misurare».
    3. Ripetere l'operazione per il punto nello stesso pozzetto sull'immagine di peak stretch. Ripeti per il resto dei pozzetti.
11. Calcola la deformazione lagrangiana nelle direzioni x e y come segue:
    
    nota: Qui, E_xx è la deformazione lagrangiana nella direzione x, E_yy è la deformazione lagrangiana nella direzione y, X è la larghezza del punto, Y è l'altezza del punto, _f denota l'immagine finale (cioè l'immagine del picco di indentazione) e _i denota l'immagine iniziale (cioè l'immagine pre-indentazione). Fare la media dei due valori per determinare la deformazione in quel pozzo.

4. Placcatura delle cellule coltivate

1. Autoclavare in autoclave i contenitori e i pesi di zavorra che verranno utilizzati per la sterilizzazione.
2. Il plasma tratta le piastre con fondo in silicone con il lato destro rivolto verso l'alto per 60 s (vedere il passaggio 1.1). Immergere immediatamente le piastre in contenitori sterili contenenti etanolo al 70% per 15 minuti.
3. Immergere le piastre in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in contenitori sterili separati per 30 minuti.
4. Aspirare il PBS dai pozzi. Asciugare solo una piastra alla volta per evitare che i pozzetti perdano il trattamento al plasma.
   cautela: Le piastre con fondo in silicone forniscono un feedback tattile inferiore rispetto alle piastre rigide durante il pipettaggio e hanno maggiori probabilità di bloccare la punta di una pipetta.
5. Aggiungere 100 μL di 0,1 mg/mL di poli-L-ornitina (PLO) per pozzetto alle piastre sterilizzate. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora.
6. Sciacquare due volte i pozzetti con 100 μL di PBS sterile, lasciando il secondo lavaggio sui pozzetti fino a quando la sospensione cellulare non è pronta.
7. Rimuovere la fiala di hiPSCN dalla conservazione dell'azoto liquido utilizzando guanti di sicurezza e posizionarla su ghiaccio secco. Trasportare rapidamente la fiala a bagnomaria a 37 °C e scongelarla per esattamente 3 minuti. Non agitare il flaconcino.
8. In una cappa sterile, trasferire delicatamente il contenuto del flaconcino in una provetta conica da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica da 1 mL.
9. Sciacquare la fiala criogenica vuota con 1 ml di terreno di mantenimento completo a temperatura ambiente (base media + supplemento).
10. Trasferire 1 mL di terreno nella provetta da 50 mL goccia a goccia a circa una goccia al secondo. Agitare delicatamente il tubo mentre lo si aggiunge. Aggiungere 8 mL di terreno di mantenimento completo a temperatura ambiente alla provetta da 50 mL a circa 2 gocce/s.
11. Tappare il tubo e capovolgerlo 2-3 volte. Contare le cellule con un emocitometro. Calcolare il volume del terreno aggiuntivo necessario per diluire la sospensione cellulare a 225.000 cellule/mL.
12. Pipettare delicatamente la quantità di terreno (calcolata sopra) nella provetta di sospensione cellulare utilizzando una pipetta sierologica da 25 mL.
13. Aggiungere 10 μL di 1 mg/mL di laminina per 1 mL di sospensione cellulare con una micropipetta da 1.000 μL per ottenere 10 μg/mL di laminina nella sospensione cellulare. Aspirare su e giù una volta con la punta utilizzata per la laminina, quindi tappare il tubo e capovolgere il tubo una volta.
14. Aspirare il PBS dalle piastre, una piastra alla volta. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 μl della sospensione cellulare hiPSCN a ciascun pozzetto. I pozzetti hanno un'area di coltura di 0,33 cm², quindi la densità cellulare per area è di 67.500 cellule/cm².
15. Far riposare le piastre a temperatura ambiente per 15 minuti dopo la semina per favorire l'adesione. Per evitare le vibrazioni della ventola della cappa di coltura sterile, posizionare le piastre coperte sul banco del laboratorio. Incubare le colture a 37 °C con il 5% di CO₂.
16. Eseguire un cambio completo del terreno a 24 ore, riempiendo i pozzetti con 200 μl di terreno di manutenzione completo. Eseguire un cambio del mezzo terreno di 100 μL/pozzetto ogni 2-3 giorni.

5. Danneggiare le culture

1. Allineare il blocco del penetratore e trovare la posizione zero come descritto al punto 2.2. Lubrificare i penetratori come descritto al punto 2.3.
2. Impostare il nome del file per la cronologia degli spostamenti nel 'position tracker VI' (passaggio 2.4.4). Impostare i parametri di lesione nel 'Motion Control VI' (passaggio 2.4.5).
3. Estrarre la piastra da ferire dall'incubatrice e fissarla al tavolino. Regolare la posizione del coperchio per fissare la piastra senza esporre le colture all'aria ambiente.
4. Abbassare la piastra fino al punto zero (passaggi 2.2.4-2.2.6) utilizzando il 'controllo del movimento VI'. Avvia il 'tracker di posizione VI' (passaggio 2.4.4).
5. Utilizzare il controllo del movimento VI per far rientrare la piastra (come descritto al punto 2.4.6). Per gli allungamenti fittizi, salta solo questo passaggio.
6. Riportare il tavolino al massimo del suo raggio di movimento (vedere il passaggio 2.4.7). Rimettere la piastra nell'incubatrice.
7. Ispezionare e salvare la traccia di spostamento (come al punto 2.4.8).

Risultati

Figura 1: Uno schema etichettato del dispositivo per lesioni.(A) vista dall'alto, (B) vista isometrica, (C) vista frontale, (D) vista laterale destra. La barra della scala si applica alle viste ortogonali (A, B e D).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
.010" Foglio di silicone	Produzione specializzata, Inc	#70P001200010	Foglio di polidimetilsilossano (PDMS)
Sparkleen	Fisher Scientifico	#043204
Nunc 256665	Fisher Scientifico	#12-565-600	Piastra a 96 pozzetti senza fondo
Salviette Kim	ULINE	S-8115
Pulitore al plasma	Harrick Plasma	#PDC-001-HC
(3-amminopropil) trietossisilano	Sigma-Aldrich	#440140	APTES
Carta pergamena	Reynolds	N/A
Luce a cupola	CCS inc	LFX2-100SW
Alimentatore per luce a cupola	CCS inc	PSB-1024VB
Unità di illuminazione diffusa assiale	Siemens	Nerlite DOAL-75-LED	Luce assiale diffusa
Array di LED ad alta potenza	Cree	XLamp CXA2540	Array di LED ad alta potenza
Supporto LED	Molex	1807200001	Supporto LED
Alimentazione LED	Significa bene	HLG-320H-36B	Alimentatore a corrente costante
Software FastCam Viewer	Fototrone		camera softeware
Fastcam Mini UX50	Fototrone	N/A	Telecamera ad alta velocità
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8	Nikon	#1455	Obiettivo della fotocamera ad alta velocità
0,1 mg/mL di poli-L-ornitina	Sigma-Aldrich	#P4597
iCelle	Dinamica cellulare internazionale	#NRC-100-010-001
Supporti iCell	Dinamica cellulare internazionale	#NRM-100-121-001
Integratore iCell	Dinamica cellulare internazionale	#NRM-100-031-001
Laminina	Sigma-Aldrich	#L2020
attuatore a bobina mobile	BEI Kimco	LA43-67-000A
encoder lineare ottico	Renishaw	T1031-30A
servoazionamento	Controlli Copley	Xenus XTL
controllore	Strumenti nazionali	Controller PowerPC in tempo reale cRIO 9024
Telaio cRIO	Strumenti nazionali	cRIO 9113
Modulo di ingresso digitale	Strumenti nazionali	NI 9411
Telaio di acquisizione dati	Strumenti nazionali	NI 9113
LabVIEW	Strumenti nazionali
hiPSCN	Dinamica cellulare internazionale