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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Animali
- Mantenere il ceppo TgBAC (gfap:gfap-GFP) zebrafish 167 (AB) di età compresa tra 6 e 9 mesi in condizioni standard in acqua con una temperatura di 26,5 °C e un ciclo luce/buio di 14/10 ore.
2. Anestesia sistemica reversibile
- Preparare la soluzione madre di sale di etil-3-amminobenzoato metanosolfonato (tricaina) sciogliendo 400 mg di polvere di tricaina in 97,9 mL di acqua del serbatoio e 2,1 mL di 1 M di soluzione salina tamponata Tris (TBS). Regolare a pH 7,0 con 1 M Tris (pH 9) e conservare a 4 °C al buio fino a un mese.
nota: La tricaina deve essere preparata in acqua come le condizioni di vita naturali dell'animale, preferibilmente deve essere utilizzata l'acqua originale del serbatoio.
- Diluire la soluzione madre a 1:25 in acqua del serbatoio e utilizzare immediatamente.
- Mettere il pesce zebra in una capsula di Petri di 10 cm contenente 50 ml di soluzione anestesiologica fino a quando non diventa immobile e non risponde agli stimoli esterni (circa 2 - 5 minuti, a seconda del peso e dell'età).
- Trasferisci ogni pesce a mano su un supporto per spilli in silicone su misura per il trattamento laser (Figura 1A).
cautela! I pesci possono rimanere anestetizzati all'esterno della vasca per un massimo di 10 minuti.
- Per invertire l'anestesia dopo il trattamento e/o l'imaging, posizionare il pesce zebra in un contenitore contenente acqua della vasca.
- Per favorire il recupero, creare un flusso di acqua fresca in vasca sulle branchie muovendo il pesce zebra avanti e indietro nell'acqua.
3. Lesione focale laser sulla retina
NOTA: Un laser a diodi da 532 nm viene utilizzato per creare danni alla luce focale sulla retina del pesce zebra. La configurazione sperimentale del laser consente di stabilire una lesione retinica focale riproducibile in zebrafish adulto.
- Impostazione della potenza di uscita del laser: 70 mW; diametro dell'antenna: 50 μm; durata dell'impulso: 100 ms.
cautela! L'uso della luce laser richiede un'adeguata protezione personale e l'etichettatura dell'area.
- Applicare 1 - 2 gocce di idrossipropilmetilcellulosa al 2% per via topica nell'occhio prima del trattamento e utilizzare una lente laser del fondo oculare da 2,0 mm per focalizzare il raggio di puntamento laser sulla retina><.
cautela! Le gocce di idrossipropilmetilcellulosa sono viscose e possono causare problemi di respirazione se va sulle branchie.
- Posizionare quattro punti laser attorno al nervo ottico dell'occhio sinistro e utilizzare l'occhio destro non trattato come controllo interno.
