Misurazione dell'attivazione del recettore degli odori utilizzando un saggio ciclico in tempo reale dell'adenosina monofosfato

Abstract

Fonte: Zhang, Y. et al., Misurazione su cellule vive dell'attivazione del recettore degli odori utilizzando un test cAMP in tempo reale. (2017)

Questo video dimostra il protocollo per misurare l'attivazione del recettore degli odori nelle cellule trasfettate utilizzando un biosensore di adenosina monofosfato ciclico (cAMP) e il rilevamento della luminescenza. Il metodo viene applicato per studiare le interazioni recettore-ligando e le vie di segnalazione nei neuroni olfattivi.

Protocollo

1. Stimolazione e misurazione dell'attività del recettore degli odori (OR) utilizzando il test cAMP in tempo reale

1. Osservare le cellule trasfettate al microscopio a contrasto di fase per garantire una corretta confluenza del 50-80% per pozzetto e riportarle all'incubatore.
2. Preparare il mezzo di stimolazione aggiungendo 10 mM di acido idrossietilpiperazineetansolfonico (HEPES) e 5 mM di glucosio alla soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS).
3. Scongelare le aliquote dei reagenti del substrato del saggio cAMP in tempo reale sul ghiaccio. Conservare il reagente del substrato a -80 °C a 55 μl per provetta in provette di reazione a catena della polimerasi (PCR). Utilizzare 1 provetta per piastra.
4. Preparare una soluzione di equilibrio al 2% mescolando 55 μl del reagente del substrato e 2750 μl di soluzione HBSS/HEPES/glucosio.
5. Stendere uno spesso strato di carta assorbente sulla panchina. Picchiettare delicatamente e ripetutamente la piastra capovolta sul tovagliolo di carta in modo che il mezzo di trasfezione venga completamente assorbito da esso.
6. Lavare le cellule pipettando 50 μl di soluzione HBSS/HEPES/glucosio in ciascun pozzetto.
7. Picchiettare delicatamente e ripetutamente la soluzione HBSS/HEPES/glucosio dalla piastra a 96 pozzetti.
8. Pipettare 25 μl di soluzione di equilibratura al 2% in ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente al buio per 2 ore.
9. Preparare in anticipo 1 M di soluzioni madre odorizzanti in dimetilsolfossido (DMSO) e conservare a -20 °C fino al momento dell'utilizzo.
10. Prima della fine del tempo di incubazione, diluire le soluzioni madre odorizzanti alle concentrazioni di lavoro nel mezzo di stimolazione HBSS/HEPES/glucosio.
    nota: Le concentrazioni delle diluizioni odorizzanti preparate in questa fase devono essere raddoppiate per ottenere le corrette concentrazioni finali in ciascun pozzetto.
11. Utilizzando un lettore di piastre a chemiluminescenza e prima dell'aggiunta di odore, misurare il livello di luminescenza basale della piastra per 2 volte consecutive a una velocità di 1000 ms per pozzetto.
12. Rimuovere rapidamente la piastra dal lettore di piastre, aggiungere 25 μL di diluizioni odorizzanti a ciascun pozzetto e avviare immediatamente la misurazione continua della luminescenza di tutti i pozzetti per 20 cicli entro 30 min.
    nota: Pipettare con cura per evitare di contaminare i pozzetti vicini quando si utilizzano odori diversi e/o concentrazioni diverse degli stessi odorizzanti nella stessa piastra.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dmso	sigma	D2650
Reagente GloSensor cAMP	Promega	E 1290
HBSS, senza cloruro di calcio e cloruro di magnesio	GIBCO	14175095
HEPES	Clone	SH30237
Muscone	Santa Cruz	SC-200528
Muschio tibetene	Sigma-Aldrich	S359165
PBS, senza calcio o magnesio	Cellgro	21-040-CV
Provetta per PCR da 0,2 mL	Axygen	PCR-02-C
Provetta Eppendorf da 1,5 mL	Eppendorf
Provetta conica da 15 mL 17 mm x 120 mm	Falco BD	352096
pipettatore multicanale a 8 e/o 12 pozzetti	Eppendorf
Piastra per coltura cellulare bianca a fondo piatto a 96 pozzetti	Greiner	655098
Piastra per colture cellulari da 100 mm x 20 mm	Falco BD	353003
Lettore di piastre Infinite F200	Tecan