Caratterizzazione dello spazio extracellulare in una fetta di cervello utilizzando microelettrodi iono-selettivi e ionoforesi

Abstract

Fonte: Odackal, J., et al. Ionoforesi in tempo reale con tetrametilammonio per quantificare la frazione di volume e la tortuosità dello spazio extracellulare cerebrale. J. Vis. Exp. (2017)

Questo video dimostra come caratterizzare lo spazio extracellulare in una fetta di cervello utilizzando microelettrodi iono-selettivi e ionoforesi per misurare e confrontare i segnali elettrici. Questo processo aiuta a determinare la frazione di volume dello spazio e il grado di torsione.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Ionoforesi in tempo reale nelle fette di cervello

1. Posizionare una fetta di cervello spessa 400 μm nella camera di registrazione, assicurandosi che sia completamente immersa nel liquido cerebrospinale artificiale che scorre (ACSF). Posizionare la fetta con un pennello da acquerello e fissarla delicatamente con una griglia.
2. Spostare sia il microelettrodo di ionoforesi che l'ISM sopra il campo di interesse sulla fetta di cervello. Immergere sia nell'ACSF che scorre ma sopra la fetta.
3. Offset della tensione sia per il canale di riferimento che per quello di rilevamento ionico a "0" mV. Attendere che la tensione in entrambi i canali si stabilizzi. Sul registratore grafico, contrassegnare la tensione misurata sul canale di rilevamento ionico dell'ISM. Utilizzare questa opzione per calcolare il parametro V di base in Wanda.
4. Posizionare l'ISM e il microelettrodo per ionoforesi a 200 μm di profondità nella fetta e a 120 μm di distanza l'uno dall'altro. Attendere la stabilizzazione del segnale dopo aver spostato il microelettrodo nella fetta cerebrale.
   nota: La corrente di polarizzazione applicata al microelettrodo di ionoforesi provoca un piccolo accumulo di tetrametilammonio (TMA). È un errore comune effettuare una registrazione troppo presto e sottovalutare l'accumulo di segnale.
5. Sul registratore grafico, segnare la tensione stabilizzata misurata nella fetta cerebrale sul canale di rilevamento ionico dell'ISM. Calcolare la differenza di tensione tra il segnale TMA misurato al punto 8.3 e al passaggio 8.4 e inserire questo valore nel campo "Baseline V (mV)" nella scatola dell'elettrodo di misura dell'interfaccia grafica Wanda.
6. Sul lato sinistro della GUI, assicurarsi che tutti i parametri sperimentali siano registrati/inseriti correttamente. Impostare "Medio" su "Cervello", "Numero di trasporto" sul valore medio calcolato per il microelettrodo di ionoforesi al punto 7.4 e "Temperatura" sulla temperatura del bagno contenente la fetta.
   NOTA: V deve essere registrato per ogni serie di misurazioni. Il basale V sarà convertito da Wanda nel parametro basale C (mM) (cioè la concentrazione di TMA nel tessuto cerebrale).
7. Avvia la registrazione facendo clic su "Acquisisci" e consentigli di effettuare una registrazione completa. Attendere che il segnale TMA ritorni alla linea di base prima di acquisire una nuova registrazione.
8. Effettuare due o tre registrazioni successive prima di rimuovere i microelettrodi dalla posizione del cervello prescelta. Inserire la temperatura misurata nel software Wanda immediatamente prima di ogni registrazione.
9. Spostare entrambi i microelettrodi in diagonale sulla superficie della fetta. Sollevare entrambi ad almeno 50 μm sopra la fetta. Utilizzando il registratore grafico, determinare qualsiasi variazione tra il V misurato ora e la sua misurazione dal passaggio 8.3.
10. Centrare le punte dell'ISM e i microelettrodi iontoforetici l'uno rispetto all'altro sugli assi x, y e z. Ottenere eventuali modifiche alla spaziatura dal display della scatola di controllo del micromanipolatore.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplificatore per ISM	Dagan	Modello IX2-700 Preamplificatore intracellulare doppio	amplificatore di tensione di ioni e di riferimento con stadi di testa N=0,1 (per cilindro di riferimento) e N=0,001 (per cilindro ionico)
Miscroscopio composto biologico (con obiettivo 4x e 10x)			per la scheggiatura delle punte dei microelettrodi e l'ispezione dei microelettrodi; vari fornitori, ad es. AmScope
tubo capillare in vetro borosilicato theta	Apparato di Harvard	Warner Instruments modello TG200-4; ordine #64-0811	di vetro a doppio cilindro per microelettrodi ionoselettivi e microelettrodi ionoforetici; D.E. 2,0 mm, D.I. 1,4 mm, setto 0,2 mm, lunghezza 10 cm
registratore grafico			per registrare in continuo le tensioni su microelettrodi iono-selettivi durante la calibrazione negli standard di tetrametilammonio e durante l'esperimento RTI; ad es. Kipp & Zonen tipo BD112 diagramma a doppio cannello registrato, disponibile ricondizionato
Software commerciale	Il progetto MathWorks	MATLAB, toolbox per l'acquisizione dati	per l'acquisizione e l'analisi dei dati utilizzando i programmi Wanda e Walter. Si noti che è disponibile una licenza accademica.
occhiali protettivi per gli occhi	pescatore
microscopio composto a stadio fisso	Olimpo	BX51WI	può utilizzare altri microscopi composti con tavolini fissi
forcipe	Strumenti per la scienza	#11251-10	per scheggiare il vetro capillare; Dumond #5, preferibilmente usato e non più necessario per lavori di precisione
unità ionoforetica	Dagan	ION-100 e PS-100	ION-100 è un'unità di ionoforesi a canale singolo con conformità +/- 130 V; PS-100 è un alimentatore esterno; alternative: ad es. Axoprobe-1A prodotto da Axon Instruments (ora Molecular Devices), fuori produzione, verifica la disponibilità di unità ricondizionate (eBay e altri siti)
porta microelettrodo	WPI	M3301EH	contenere il prefabbricato microeletrodo iono-selettivo per la silanizzazione e il riempimento della punta del cilindro iono-selettivo con scambiatore di ioni liquido; WPI vende due versioni di questo supporto, M3301EH trasparente e M3301EH nero. Nella nostra esperienza, il M3301EH chiaro sembra essere più robusto del M3301EH nero.
micromanipolatore	Narishige	MM-3	per posizionare il microelettrodo iono-selettivo prefabbricato durante la silanizzazione e il riempimento della punta del cilindro iono-selettivo con scambiatore di ioni liquido; può essere sostituito con qualsiasi micromanipolatore a tre assi in buone condizioni di lavoro
Obiettivo 5x asciutto	Olimpo	MPlan N
Obiettivo 10x immersione in acqua	Olimpo	UMPlan FL N	L'obiettivo 10x è a immersione in acqua, l'apertura numerica è 0,3, la distanza di lavoro è 3,3 mm
Piattaforma e tavolino di traslazione X-Y per microscopio a stadio fisso	EXFO	Gibilterra Burleigh	La piattaforma contiene la camera di taglio, i micromanipolatori e gli accessori, il tavolino traslazionale X-Y muove il microscopio senza compromettere la stabilità di registrazione
Micromanipolatore robotico con posizionamento preciso X, Y, Z	Strumenti Sutter	MP-285	Sono necessari due micromanipolatori per tenere separati il microelettrodo iono-selettivo e il microelettrodo ionoforetico. È anche possibile incollare micropipette in una matrice distanziata (vedi testo).
Condizionatore di segnale con filtro passa-basso	Strumenti Axon	CyberAmp 320 o 380	non più disponibile presso il produttore, ma potrebbe essere disponibile presso E-Bay; alternative: ad es. Filtro/amplificatore FLA-01 di Cygnus Technology. Si tratta di uno strumento a canale singolo con un taglio minimo a 10 Hz che utilizza un filtro Bessel multipolare, ma l'azienda potrebbe essere disposta a modificarlo per una frequenza di taglio più bassa (2 Hz), se necessario.
filo d'argento	Sistemi A-M	#7830	diametro 0,015", nudo (senza rivestimento)
camera di taglio	Apparato di Harvard	Warner Modello RC-27L	Questa è una camera di fetta di immersione; non utilizzare la camera di fetta di interfaccia
Stereomicroscopio			per la silanizzazione e il riempimento della punta del cilindro iono-selettivo con scambiatore di ioni liquido; montato orizzontalmente; fornitori vari
cloruro di tetrametammonio (TMA)	Sigma-Aldrich	T-3411	Soluzione 5 M; ATTENZIONE: tossicità acuta (orale, cutanea, per inalazione), cancerogenicità, pericoloso per l'ambiente acquatico, vedere le Informazioni sulla sicurezza Sigma-Aldrich per la descrizione completa