Misurazione dei livelli di acido retinoico nelle neurosfere utilizzando una linea cellulare reporter di acido retinoico

Abstract

Fonte: Ababon, M. R. et al., Misurazione quantitativa dei livelli relativi di acido retinoico in embrioni E8.5 e colture di neurosfere utilizzando il saggio reporter basato su cellule F9 RARE-Lacz.J. Vis. Exp.(2016).

Questo video dimostra la misurazione della secrezione di acido retinoico (RA) dalle cellule della neurosfera utilizzando cellule reporter RA. Delinea i passaggi coinvolti nella co-coltura delle cellule della neurosfera con le cellule reporter dell'AR e nell'esecuzione di un test colorimetrico dell'AR per misurare i livelli di AR.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Preparazione della Soluzione e dei Terreni

1. Preparare le soluzioni madre e tampone come da Tabella 1. Preparare le soluzioni di lavoro come da Tabella 2.

2. Coltura e mantenimento di cellule F9 RARE-LacZ

1. Scongelamento delle celle congelate
   1. Preparare il terreno di coltura cellulare F9 RARE-LacZ come descritto nella Tabella 2.
   2. Rivestire le piastre di coltura da 10 cm (trattate con coltura cellulare) con 10 ml di gelatina allo 0,2% (fare riferimento alla Tabella 2) per 30 minuti a RT. Lavare via la gelatina in eccesso con due risciacqui di 10 ml di acqua distillata. Aggiungere immediatamente 9 ml di terreno di coltura cellulare F9 RARE-LacZ nel pallone per evitare che la gelatina si asciughi.
   3. Scongelare una fiala di cellule F9 RARE-LacZ in un bagno d'acqua a 37 °C per 2 - 3 minuti. Piastra le cellule (circa 1 x 10⁶ cellule/ml) nel piatto rivestito contenente 9 ml di terreno di coltura. Coltura a 37 °C, 5% CO₂. Cambia il mezzo il giorno successivo.
2. Mantenimento delle cellule F9 RARE-LacZ
   1. Mantenere un passaggio regolare ogni 2 - 3 giorni con un rapporto di 1:10,
      nota: Non lasciare che le cellule crescano in confluenza poiché ciò comporterà la loro differenziazione.
   2. Dividi le colture con una confluenza dell'80-90%. Rimuovere il terreno e lavare le cellule con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS). Rimuovere il PBS e aggiungere 1 ml di tripsina, incubare per 5 minuti. Aggiungere 9 ml di terreno di coltura, pipettare su e giù e dividere le cellule 1:10 per il passaggio.
3. Congelamento di cellule F9 RARE-LacZ
   1. Tripsinizzare una piastra di 10 cm contenente cellule F9 RARE-LacZ all'80 - 90% di confluenza, come descritto al punto 2.2.2. Trasferire le cellule dissociate in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 200 x g per 5 minuti.
   2. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno di congelamento F9 RARE-LacZ (vedere Tabella 2). Aliquotare 1 ml in crioviali etichettati e trasferire i flaconcini in contenitori di congelamento. Mettere il contenitore di congelamento in un congelatore a -80 °C O/N e trasferire le fiale in serbatoi di azoto liquido il giorno successivo.

3. Laminectomia, dissezione del midollo spinale lombare adulto e coltura della neurosfera

1. laminectomia
   1. Sacrificare un topo adulto (P60) attraverso la lussazione cervicale.
   2. Spruzzare il lato dorsale con etanolo al 70% ed eseguire un taglio trasversale utilizzando le forbici chirurgiche. Separare entrambi i lembi (anteriore e posteriore) per esporre la schiena e la colonna vertebrale.
   3. Usando le forbici chirurgiche, taglia i muscoli che coprono la colonna vertebrale. Individua la regione lombare del midollo spinale sotto le costole. Usando le forbici, fai un taglio profondo per recidere la colonna vertebrale a questo punto per esporre il midollo spinale.
   4. Sollevare la regione lombare della colonna vertebrale con n. 5 pinze in modo che la sezione trasversale esposta del midollo spinale sia rivolta verso lo sperimentatore. Usando le punte delle forbici sottili, taglia la vertebra e il muscolo a ore 3 e 9 dell'estremità esposta. Afferrare il lembo dorsale della vertebra tagliata con una pinza. Continuare questi tagli caudalmente fino a quando la lunghezza del midollo spinale lombare non è esposta.
   5. Rilasciare il midollo spinale dalle vertebre utilizzando il n. 5 e una pinza smussata. Trasferire il midollo spinale in una provetta da 15 ml contenente 3 ml di terreno di coltura DMEM/F12. Mantenere il ghiaccio fino a quando tutto il midollo spinale lombare non è stato isolato.
2. Dissezione del midollo spinale
   1. Versare il terreno di coltura con il midollo spinale in un piatto di 6 cm (non trattato con coltura cellulare).
   2. Sotto uno stereomicroscopio, rimuovere i gangli della radice dorsale e i vasi sanguigni attorno al segmento del midollo spinale afferrandoli con due paia di pinze n. 5 ed estraendoli delicatamente dal midollo spinale. Trasferire il segmento del midollo spinale in un piatto di 6 cm senza terreno e tritare finemente il tessuto con una lama di bisturi.
   3. Trasferire il tessuto macinato in una provetta da 15 ml contenente 1 ml di terreno di dissociazione della neurosfera (vedere Tabella 2). Mettere il tubo sul ghiaccio e ripetere i passaggi 3.2.1 - 3.2.2 fino a quando tutto il midollo spinale è stato processato.
   4. Incubare le provette contenenti tessuto tritato in terreno di dissociazione a 37 °C per 10 minuti, muovere la provetta lateralmente per mescolarla e incubare a 37 °C per altri 10 minuti. Dopo la digestione enzimatica, triturare con pipette lucidate a fuoco di diametro decrescente per la dissociazione meccanica.
      nota: Preparare pipette lucidate a fuoco di diametro decrescente prima di eseguire gli esperimenti. Prendi una pipetta di vetro Pasteur e tappa l'estremità larga con del cotone pulito. Utilizzando una lampada ad alcool, lucidare a fuoco le punte delle pipette nella fiamma per creare diversi diametri: "regolare", "fine" ed "extra fine". Per le pipette lucide "normali", far roteare l'estremità della pipetta nella fiamma per arrotondare i bordi senza diminuire il diametro (~ 1 mm). Ruotare l'estremità della pipetta nella fiamma per un periodo leggermente più lungo per creare pipette lucide "fine" (~ >1 mm e > 5 mm di diametro) e "extra fine" (~ 0,5 mm). Non utilizzare pipette con diametro inferiore a 0,5 mm.
3. Cultura della Neurosfera
   1. Centrifugare le provette contenenti tessuto dissociato del midollo spinale a 200 x g per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno di coltura della neurosfera (vedere Tabella 2). Triturare con una pipetta P1.000 seguita da una pipetta P200 per facilitare la dissociazione.
      nota: Evitare l'introduzione di bolle, che ridurrebbero la vitalità cellulare.
   2. Trasferire 10 μl di cellule dissociate in un emocitometro e ottenere una conta cellulare. Piastre le cellule ad una densità di 1x10⁵/10 ml in un pallone T25 con 10 ml di terreno di coltura della neurosfera. Incubare a 37 °C e 5% di CO₂ per 7 giorni fino alla comparsa delle neurosfere.
4. Dissociazione della neurosfera
   1. Raccogliere la coltura della neurosfera e trasferirla in provette da 15 mL. Centrifugare a 200 x g per 10 min. Rimuovere la maggior parte del surnatante lasciando 1 ml. Triturare con una pipetta P1.000 per risospendere il pellet cellulare e dissociare le neurosfere in singole cellule. Trasferire 10 μl di cellule dissociate in un emocitometro e ottenere una conta cellulare.
   2. Piastra 1 x 10⁵ cellule della neurosfera dissociate su un pozzetto di F9 RARE-LacZ in una piastra a 96 pozzetti (vedere paragrafo 5.1 per la placcatura di F9 RARE-LacZ in una piastra a 96 pozzetti). Piastra 3 pozzetti come repliche. O/N di coltura a 37 °C e 5% di CO₂.

4. Saggio dell'acido retinoico (RA) delle neurosfere del midollo spinale

1. Placcatura F9 RARE-LacZ in piastra a 96 pozzetti
   1. Un giorno prima della dissociazione delle neurosfere, rivestire una piastra da 96 pozzetti con 100 μl di gelatina allo 0,2% per pozzetto per 30 minuti a RT. Aspirare la gelatina e risciacquare due volte con 200 μl di acqua distillata.
   2. Tripsinizzare le cellule F9 RARE-LacZ mantenute in piastre da 10 cm, come descritto al punto 2.2.2. Piastra 1 x 10⁵ cellule/pozzetto di cellule LacZ F9-RARE, ma questa volta utilizzando terreno di coltura senza G418.
   3. Preparare un numero sufficiente di pozzetti per la co-coltura di neurosfere (3 pozzetti/genotipo) e per una curva standard in triplicato (27 pozzetti).
2. Co-coltura di F9 RARE-LacZ e neurosfere del midollo spinale
   1. Dissociare le neurosfere e la piastra sopra F9 RARE-LacZ nella piastra a 96 pozzetti come descritto nel passaggio 3.4. O/N di coltura a 37 °C e 5% di CO₂.
3. Generazione di una curva standard
   1. Per generare una curva standard, preparare soluzioni all-trans di AR (at-RA) con le seguenti concentrazioni: 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM, 100 fM, mediante diluizione seriale del materiale madre at-RA (vedere la tabella 1) con terreno di coltura F9 RARE-LacZ.
   2. Aggiungere 100 μl di queste diverse concentrazioni di at-RA alle cellule F9 RARE-LacZ della sezione 4.1. Assegnare i pozzetti contenenti cellule F9 RARE-LacZ non trattate come controllo negativo. Preparare triplicati di ogni concentrazione di AR e pozzetti di controllo negativo. O/N di coltura a 37 °C e 5% CO₂.
      nota: Le cellule F9 RARE-LacZ rispondono in modo lineare dose-dipendente a concentrazioni variabili di AR all-trans.
4. Saggio RA
   1. Dopo la coltura O/N della piastra a 96 pozzetti contenente le curve standard e le co-colture, rimuovere il terreno e fissare le colture aggiungendo 100 μl di glutaraldeide al 2,5% (vedere Tabella 2) per 15 min, RT. Rimuovere il fissativo e lavare due volte con 200 μl di 1x PBS, 10 min per lavaggio.
   2. Rimuovere il PBS e lavare tre volte con 200 μl della soluzione di lavaggio LacZ (vedere Tabella 2), 10 minuti per lavaggio. Durante il terzo lavaggio, preparare la soluzione colorante X-gal in una provetta da 15 ml avvolta in un foglio di alluminio (vedere Tabella 2). Calcolare la quantità di soluzione colorante necessaria e preparare la quantità appropriata (200 μl/pozzetto).
      nota: La soluzione colorante X-gal è sensibile alla luce. Utilizzare la soluzione colorante entro 15 minuti dalla preparazione.
   3. Preparare una camera umidificata mettendo un tovagliolo di carta inumidito con acqua distillata in un contenitore di plastica abbastanza grande da contenere una piastra da 96 pozzetti. Aggiungere 200 μl della soluzione colorante X-gal per pozzetto della piastra a 96 pozzetti e posizionare la piastra in una camera umidificata.
   4. Incubare la camera umidificata contenente la piastra a 96 pozzetti a 37 °C per 4 - 8 ore per consentire lo sviluppo del precipitato di colore blu.
5. Lettura dell'assorbanza a OD₆₁₀ e imaging
   1. Dopo la reazione cromatica, rimuovere la soluzione colorante LacZ e sostituirla con 200 μl 1x PBS. Misurare l'assorbanza a 610 nm utilizzando un lettore di piastre ELISA standard per quantificare la risposta del reporter all'artrite reumatoide. Immagine di singoli pozzetti utilizzando uno stereomicroscopio standard dotato di fotocamera.

Tabella 1. Tamponi e composizioni di soluzioni.

Buffer/Soluzioni di stock	Componenti	Condizioni di conservazione
10% Sodio desossicolato monoidrato (C24H39NaO4 · H2O)	10 ml in 100 ml dH2O	4 ºC
1 M di cloruro di magnesio (MgCl2)		Rt
100x ferrocianuro di potassio (K4[Fe(CN)6]·3H6O)	2,12 g in 10 ml dH2O	RT al buio
100x ferricianuro di potassio (K3[Fe(CN)6])	1,64 g in 10 ml dH2O	RT al buio
20 mg/ml di X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-galattopiranoside)	Aggiungere 5 ml di dimetilformammide per ottenere una soluzione madre da 20 mg/ml	-20 ºC
10 mM (3 mg/ml) di acido retinoico all-trans	Sciogliere 50 mg in 16,67 ml di etanolo assoluto. Preparare 1 ml di aliquote.	-80 ºC al buio, in provette per microcentrifuga ambrate da 1,5 ml
papaina	sciogliere un flaconcino in 7 ml di HBSS	4 ºC

Tabella 2. Tamponi di lavoro e composizioni di soluzioni.

Buffer/Soluzioni di lavoro	Componenti	Condizioni di conservazione
Terreno di coltura cellulare F9 RARE-LacZ	50 ml di siero fetale bovino (FBS) (concentrazione finale 10%)	Filtrare-sterilizzare.
	5 ml 100x Penicillina Streptomicina (conc finale 1X)	Conservare a 4 ºC.
	4 ml 50 mg/ml G418 (condensazione finale 0,4 mg/ml)
	fino a 500 ml di DMEM/F-12 (con L-glutammina e HEPES)
0,2% di gelatina	25 ml di gelatina al 2,0%	Conservare a 4 ºC.
	80 ml di acqua distillata
	Mescola bene
70% etanolo	30 ml di etanolo al 95%	Mettere nel flacone spray.
	70 ml di acqua distillata	Negozio presso RT
Mezzo di dissociazione della neurosfera	1 ml 20U di papaina	preparare fresco ogni volta
	100 μl 13 mg/ml di tripsina
	100 μl 7 mg/ml di acido ialuronico
	28 μl 10 mg/ml DNaseI
	50 μl 4mg/ml di acido chinurenico
Terreno di coltura della neurosfera	DMEM/F-12 (con L-glutammina e HEPES)	preparare fresco ogni volta
	Supplemento del 2% per la vitamina B-27
	20 ng/ml di fattore di crescita dei fibroblasti (FGF)
	20 ng di fattore di crescita epidermico (EGF)
2,5% di glutaraldeide	250 μl 50% glutaraldeide	preparare fresco ogni volta
	4750 μl 1x PBS
Soluzione di lavaggio LacZ	0,5 ml di desossicolato al 10% (conc finale 0,1%)	Conservare a 4 ºC.
	1,0 ml 100% NP-40 (condensazione finale 0,2%)
	50 ml 10X PBS
	acqua distillata fino a 500 ml
Soluzione colorante X-gal	1x ferrocianuro di potassio	preparare fresco ogni volta
	1x ferricianuro di potassio
	1 mg/ml di X-gal
	al volume appropriato utilizzando la soluzione di lavaggio LacZ
F9 RARE-LacZ mezzo di congelamento	Terreno di coltura F9 RARE-LacZ + 5% DMSO	preparare fresco ogni volta

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ceppo di topo C3H/HeSn-Gpr161vl/J	Laboratorio Jackson	316
Linea cellulare reporter F9 RARE-LacZ			dal Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) e Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, Università della Virginia)
DMEM/F-12 (con L-glutammina e HEPES)	ThermoFisher Scientifico	Codice 11330-057
Siero Fetale Bovino (FBS), qualificato	ThermoFisher Scientifico	Codice 26140-079	Conservare a -20 °C in aliquote da 10 ml per evitare ripetuti geli-scongelamenti; riscaldare a 37 C per la preparazione dei terreni
Penicillina/Streptomicina	ThermoFisher Scientifico	Codice: 15140-122	Conservare a -20 °C in aliquote da 10 ml per evitare ripetuti atti di gelo-disgelo;
G418	ThermoFisher Scientifico	Codice 10131-027	Conservare a 4 °C; sensibile alla luce
2% Gelatina	Sigma Aldrich	G1393	Conservare a 4 °C
Integratore di B-27 (soluzione madre al 2	ThermoFisher Scientifico	Codice 17504-044	Conservare a -20 °C in aliquote da 1 ml per evitare ripetuti atti di gelo-disgelo; riscaldare a temperatura ambiente per la preparazione dei terreni
Fattore di crescita epidermico murino (EGF)	PeproTech	315-09	Preparare 100 μg/ml di soluzione madre in albumina sierica bovina (BSA) allo 0,1% in 1X PBS; preparare le concentrazioni di lavoro diluendo con 1X PBS; conservare a -20 °C
Fattore di crescita dei fibroblasti murini (FGF)-basico	PeproTech	450-33	Preparare 100 μg/ml di soluzione madre in albumina sierica bovina (BSA) allo 0,1% in 1X PBS; preparare le concentrazioni di lavoro diluendo con 1X PBS; conservare a -20 °C
50% di glutaraldeide	Amresco	M155	Conservare a 4 C
Sodio desossicolato monoidrato (C24H39NaO4 · H2O)	Sigma Aldrich	D5670	Conservare a temperatura ambiente
ferrocianuro di potassio [K4[Fe(CN)6] · 3H2O)	Sigma Aldrich	P-9387	Conservare a temperatura ambiente
ferricianuro di potassio (K3[Fe(CN)6])	Sigma Aldrich	P-8131	Conservare a temperatura ambiente
X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-d-galattopiranoside)	Promega	V3941	Conservare le scorte a -20 °C
Dimetilsolfossido (DMSO)	Sigma Aldrich	Numero 41639	Conservare a temperatura ambiente
Acido retinoico all-trans (at-RA)	Sigma Aldrich	R-2625	Conservare 1 ml di aliquote di brodo a -80 °C; estremamente sensibile alla luce
TrypLE Express	ThermoFisher Scientifico	Codice 12605-010	Conservare a temperatura ambiente
0,25% tripsina-EDTA	ThermoFisher Scientifico	Codice 25200-056	alternativa al TrypLE Express; aliquotare e conservare a -20 C
salina bilanciata di Hank (HBSS)	ThermoFisher Scientifico	Codice 14170-112	Conservare a 4 C
Soluzione tamponata con fosfato 10X (PBS)	ThermoFisher Scientifico	Codice 10010-023	Conservare a 4 C
papaina	Worthington	LK003176	Conservare a 4 °C.
tripsina	Worthington	LS003703	Conservare in aliquote da 1 ml a -20 °C.
acido ialuronico	Calbiochem	385908	Conservare 200 μl di aliquote a -20 °C.
DNaseI	Worthington	LS002139	Conservare in aliquote da 200 μl a -20 C
Acido chinurenico	Sigma Aldrich	K3375	Conservare in aliquote da 200 μl a -20 C
95% etanolo
Mr. Frosty Contenitore per il congelamento	ThermoFisher Scientifico	Codice: 5100-0001
Piatto di coltura da 10 cm (non trattato con coltura cellulare)
Piatto di coltura da 10 cm (coltura cellulare trattata)
Piatto di coltura da 6 cm (non trattato con colture cellulari)
Piastre per colture cellulari a 96 pozzetti
Provette per microcentrifuga da 1,5 ml
Provette per microcentrifuga ambrate da 1,5 ml
1,5 ml di crioviali
Bagnomaria a 37 °C
forbici chirurgiche
forbici chirurgiche fini
n. 5 pinze
pinza smussata
lama per bisturi
pipette in vetro pasteur
cotone
lampada ad alcool
Lettore di piastre ELISA
Stereomicroscopio

%) Soluzione