Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Procedura chirurgica
Nota: 20 ratti maschi di Sprague-Dawley sono stati microiniettati con proteina beta amiloide composita (Aβ) nel ventricolo laterale e nel nucleo talamico anterodorsale e designati come gruppo composito trattato con Aβ. Altri 20 ratti sono stati sottoposti alla stessa operazione, ma hanno ricevuto una microiniezione salina di dimetilsolfossido (DMSO) allo 0,1% e sono stati designati come gruppo operato con sham.
- Anestetizzare i ratti con isoflurano al 100% per inalazione, quindi trattenerli su un apparato stereotassico cerebrale.
- Radere il pelo sul vertice della testa con le forbici chirurgiche e disinfettare con iodoforo. Quindi, copri un asciugamano chirurgico usa e getta sulla testa.
- Praticare un'incisione sulla pelle della testa lungo la calvaria longitudinale mediana con bisturie chirurgiche e forbici.
- Separare il tessuto sottocutaneo e la fascia, pulire il calvario del cranio con cotone sterile e asciutto per fermare l'emorragia e contrassegnare il bregma con un pennarello.
- Fare riferimento alla mappa stereotassica del cervello di ratto considerando il bregma come punto di origine, segnare i tre punti, il nucleo talamico antero-dorsale (ad) (posteriore (P): 2,0 mm alla bregma; laterale (L): 1,4 mm alla linea mediana) per iniettare il fattore di crescita trasformante umano ricombinante-β1 (RHTGF-β1) e fissare una vite, l'area del ventricolo laterale (LV) (posteriore (P): 0,8 mm alla bregma; laterale (L): 2,0 mm alla linea mediana) per l'iniezione della proteina beta amiloide 25-35 (Aβ25-35) e del tricloruro di alluminio (AlCl3), e il secondo punto di fissaggio della vite (anteriore (F): 2,0 mm alla bregma; laterale (L): 1,5 mm alla linea mediana).
- Praticare delicatamente tre fori di 1 mm di diametro con un trapano flessibile per osso designato nei tre punti superiori del cranio (passo 1.5). Non avvitare più in profondità del necessario per evitare di pugnalare il tessuto cerebrale.
- Fermare l'emorragia e pulire ripetutamente la superficie del cranio con cotone sterile e asciutto.
- Inserire un ago collegato alla pompa di microiniezione nel cervello a una profondità di 4,6 mm e iniettare delicatamente 1 μL di RHTGF-β1 (10 ng) nell'area dell'ad. Rimanga l'ago per 2 minuti dopo l'iniezione ed estragga lentamente l'ago.
- Fissare le due viti nel cranio, indicato nei punti dell'annuncio, e il secondo punto di fissaggio a vite del cranio (che è stato designato al passo 1,5) con un piccolo cacciavite. Non avvitare più in profondità del necessario per evitare di pugnalare il tessuto cerebrale.
- Assemblare il sistema di impianto della cannula e inserire la cannula fittizia nella cannula guida dopo la disinfezione ad alta pressione.
- Inserire la cannula guida del tubo in acciaio inossidabile al cervello a 4,6 mm nell'area del ventricolo sinistro attraverso il foro del cranio con l'aiuto del supporto della cannula dell'apparato stereotassico dei ratti.
- Mescolare il materiale della base della protesi con l'acqua della base della protesi in un rapporto di 1,5 g per 1 ml, mettere la pasta per coprire il piedistallo di plastica della cannula guida e due viti per immobilizzare la cannula guida e coprire l'intera incisione cutanea per evitare infezioni cutanee.
- Il secondo giorno dell'operazione, i ratti sono stati anestetizzati con inalazione di isoflurano utilizzando la macchina per anestesia per piccoli animali. Estrarre la cannula ciuccia, inserire la cannula interna nella cannula guida e avvitare la vite di fissaggio per immobilizzare la cannula interna.
- Posizionare il tubo in polietilene che collega la pompa di microiniezione alla cannula interna e regolare la velocità di iniezione a 1 μL/min. Microiniettare l'Aβ25-35 o l'AlCl3 al ventricolo sinistro.
- Microiniettare 4 μg (1 μL) di Aβ25-35 al giorno per 14 giorni al mattino e 3 μL di AlCl3 (1%) al giorno per 5 giorni nel pomeriggio in anestesia con isoflurano.
- Attendere 5 minuti dopo aver terminato l'iniezione, estrarre delicatamente la cannula interna e inserire nuovamente la cannula fittizia nella cannula guida.
- Il giorno 15, dopo l'intervento chirurgico (che corrisponde all'ultimo giorno di iniezione di Aβ25-35), smontare il sistema di impianto della cannula. Rimuovere delicatamente il materiale di base della protesi con forbici chirurgiche e pinze, svitare le due viti, estrarre la cannula guida e disinfettare la ferita con betadine. Riempi il foro del cranio con cemento osseo e sutura la pelle usando un semplice metodo di sutura interrotta.
- Eseguire la stessa operazione con il gruppo azionato da sham e microiniettare soluzione salina DMSO allo 0,1%.
