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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Abrasione del piedino del mouse
- Anestetizzare un topo C57BL/6 (5-7 settimane di età) con un anestetico gassoso isoflurano, somministrato alla dose del 3% tramite un piccolo sistema di anestesia (camera).
- Posizionare il topo nel piano chirurgico dell'anestesia sul dorso, prima dell'inoculazione, nel cuscinetto posteriore. Attaccare un cono nasale con un diaframma (una fessura di dimensioni sufficienti per adattarsi al muso dell'animale) al topo e somministrare l'anestetico gassoso isoflurano a un dosaggio costante dell'1,5%-2,0%.
- Monitorare attentamente il mouse per una risposta allo stimolo doloroso creato dal pizzicamento forzato dell'alluce con il forcipe.
- Afferrare leggermente un cuscinetto posteriore con una pinza piatta.
- Abradere delicatamente la pelle glabra del cuscinetto posteriore di circa 20 volte, tra il tallone e i cuscinetti da passeggio, con una tavola smeriglio (grana 100-180). Non indurre sanguinamento abradendo troppo frequentemente o applicando troppa pressione.
- Usando una pinza fine, staccare lentamente lo strato corneo staccato dall'abrasione per esporre lo strato basale.
2. Inoculazione del tampone PRV
- Preparare l'inoculo virale diluito al titolo desiderato in terreno DMEM contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina (Tabella dei materiali).
- Quantificare il numero di unità formanti placche (PFU) nel patrimonio virale sulle cellule PK15 per calcolare e standardizzare la dose virale e diluire l'inoculo virale di conseguenza.
nota: In questo studio, il ceppo virulento di PRV (PRVBecker) è stato utilizzato alla dose di 8 x 106 PFU. Questa dose è stata ottimizzata in un precedente esperimento preliminare per garantire che tutti gli animali inoculati mostrassero sintomi clinici a 82 ore dopo l'inoculazione (hpi).
- Tenere l'inoculo virale in ghiaccio e mescolare delicatamente prima dell'uso.
- Aggiungere una gocciolina da 20 μl di inoculo virale (8 x 106 PFU) sul cuscinetto abraso (somministrazione topica). Eseguire le vaccinazioni simulate (solo terreno) in parallelo.
- Strofinare delicatamente 10 volte con l'asta di un ago per facilitare l'adsorbimento del virus. Evitare di graffiare con la punta dell'ago. Ripeti questo passaggio ogni 10 minuti.
- Tenere il mouse sotto anestesia per 30 minuti fino a quando il poggiapiedi abraso non è asciutto.
- Dopo aver interrotto l'anestesia, monitorare il topo fino a quando non è in grado di mantenere la decubito sternale e metterlo in una gabbia individuale per il follow-up clinico e il campionamento.