Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
C57BL/6 (H-2b) topi femmine, di 8 settimane di età, sono stati acquistati e i topi C57BL/6 AQP4-/- sono stati forniti da A. Verkman.
1. Immunizzazione di topi con peptidi AQP4
- Preparare il working stock completo di adiuvante di Freund (CFA).
- Macinare finemente un preparato essiccato di Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) utilizzando un mortaio e un pestello.
- Aggiungere H37Ra macinato all'adiuvante di Freund incompleto fino a una concentrazione finale di 4 mg/mL. Il CFA può essere conservato a 4 °C per un massimo di 6 mesi.
- Sciogliere il peptide AQP4 dell'antigene liofilizzato (Ag) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a una concentrazione finale di 1 mg/mL. Mantenere a 4 °C o con ghiaccio.
- Preparare l'assemblaggio di 2 siringhe luer-lock, unite con un rubinetto, contenenti l'emulsione CFA/peptidica.
- Collegare una siringa luer-lock in vetro senza stantuffo a un rubinetto di arresto in nylon a 3 vie con 2 connessioni luer-lock maschio. Chiudere il rubinetto spostando la leva verso la siringa. Posizionare l'estremità aperta della siringa verso l'alto, in modo che la siringa funga da provetta. Posizionalo in una rastrelliera per provette per una maggiore stabilità.
- Vortex il grezzo di lavoro CFA e la soluzione Ag. Aggiungere un volume 1:1 di peptide / CFA alla siringa aperta. Sono necessari 200 μL di CFA/Ag (4 x 50 μL) per topo.
nota: In genere, circa 1 ml di preparato viene perso nel rubinetto, il che ridurrà la quantità disponibile per l'immunizzazione. Pertanto, è importante incorporare questo nel calcolo del volume totale richiesto.
Esempio: Per l'immunizzazione di 5 topi: (200 μL/animale x 5 animali) + 1 mL di volume extra = 2 mL di CFA/Ag totale richiesto.
- Inserire lo stantuffo di vetro nella siringa e, tenendolo in posizione, capovolgere la siringa in modo che il rubinetto sia orientato verso l'alto. Portare la leva del rubinetto sull'attacco femmina non utilizzato. Applicare con cautela pressione sullo stantuffo di vetro per rimuovere l'aria in eccesso dalla siringa. Il liquido riempie il secondo raccordo luer-lock maschio del rubinetto.
- Collegare una seconda siringa di vetro (stantuffo completamente inserito) alla seconda connessione luer-lock maschio del rubinetto. Questo dovrebbe essere un sistema chiuso di 2 siringhe di vetro collegate con un rubinetto contenente la minor quantità possibile di aria in eccesso.
- Per creare un'emulsione, mescolare spingendo gli stantuffi per far passare il liquido alternativamente tra le 2 siringhe per circa 2 minuti. Raffreddare le siringhe con ghiaccio per circa 10 minuti. Ripetere l'abbattimento e la miscelazione fino a quando non si verifica un netto cambiamento nella viscosità del preparato, ottenendo un'emulsione bianca molto rigida. Refrigerare le siringhe contenenti l'emulsione a 4 °C o mantenerle con ghiaccio.
- Trasferire tutta l'emulsione in una siringa luer-lock di vetro, rimuovere la siringa di vetro vuota e sostituirla con una siringa luer-lock da 1 mL per preparazioni iniettabili. Riempire la nuova siringa con l'emulsione, rimuoverla dal rubinetto e inserire un ago (25G x 5/8).
- "Testare con l'acqua" l'emulsione per verificarne la consistenza. Espellere una goccia di emulsione in un piattino d'acqua. L'emulsione non deve disperdersi, indicando che è adatta per l'iniezione.
- Se l'emulsione si disperde, non è pronta per l'iniezione; trasferire nuovamente il liquido nelle siringhe di vetro e continuare a mescolare, quindi raffreddare nuovamente fino a quando l'emulsione non si sarà rassodata.
- Testare nuovamente l'emulsione fino a raggiungere la giusta consistenza.
- Iniettare i topi donatori AQP4-/- per via sottocutanea (s.c.) con emulsione contenente il peptide AQP4. Ogni topo riceve 4 iniezioni da 50 μL s.c. (200 μL in totale (100 μg di peptide)). I 4 siti includono entrambi i lati dell'addome inferiore, che drenano nei linfonodi inguinali (LN), ed entrambi i lati della parete toracica mediale di ciascuna ascella, che drenano nel LN ascellare. Il trasferimento adottivo richiederà 1-2 topi donatori immunizzati per topo ricevente.
2. Coltura di cellule T e polarizzazione proinfiammatoria delle cellule T
- 10-12 giorni dopo l'immunizzazione, raccogliere LN dai topi.
- In una vaschetta per il ghiaccio, preparare piastre di Petri da 60 mm dotate di un colino cellulare (dimensione della maglia 70 μm) e contenenti terreni refrigerati del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con il 10% di siero fetale bovino inattivato a caldo (FBS) e 100 U/mL di penicillina-100 μg/mL di streptomicina (pen-streptococco) (RFPS).
- Eutanasia dei topi mediante esposizione a CO2, seguita da lussazione cervicale. Immergere i topi in etanolo al 70% e poi fissare ogni pedana a una tavola di dissezione.
- Incidi una linea mediana della pelle dall'inguine al collo e lungo ogni gamba. Allontana la pelle dal peritoneo e fissala con forza alla tavola. Sezionare il LN inguinale e ascellare e metterlo nella capsula di Petri contenente RFPS, su ghiaccio.
- Per gli esperimenti di trasferimento adottivo, combinare LN di tutti gli animali all'interno dello stesso gruppo di immunizzazione. Per le analisi citofluorimetriche dell'uso di Vβ, separare il LN dai singoli animali.
- Posizionare il filtro cellulare contenente il LN su una provetta da centrifuga da 50 ml contenente RFPS. Utilizzare l'estremità piatta di uno stantuffo sterile da 5 ml per spingere le cellule LN attraverso il colino, lavando con 20-30 ml di RFPS per facilitare il recupero delle cellule. Mantenere le cellule LN sul ghiaccio durante tutta la lavorazione fino al momento della coltura.
- Lavare due volte, centrifugando a 393 x g per 5 min. Dopo il secondo lavaggio, risospendere le cellule LN nel terreno di coltura delle cellule T (MTC). La MTC contiene RPMI con il 10% di FBS inattivato termicamente, 292 μg/mL di L-glutammina, 110 μg/mL di piruvato di sodio e 55 μM di 2-mercaptoetanolo e penna-streptococco. In genere, viene utilizzato un volume di 5 mL di MTC per topo donatore.
- Contare le celle LN. La resa attesa è di circa 3-6 x 10cellule da 7 LN per donatore di topo immunizzato.
- Imposta le culture polarizzanti per il trasferimento adottivo.
- Preparare una coltura polarizzante Th17 di 5 x 10cellule LN per mL con 10 μg/mL di Ag, 20 ng/mL di interleuchina (IL)-23 di topo ricombinante e 10 ng/mL di IL-6 di topo ricombinante in MTC.
- In alternativa, per la polarizzazione Th1, preparare una coltura di 5 x 10cellule LN per mL con 10 μg/mL di Ag e 10 ng/mL di IL-12 ricombinante di topo in MTC.
- Aggiungere 2 mL (1 x 107 cellule) per pozzetto della miscela di coltura polarizzante in una piastra a 12 pozzetti. Le cellule LN di 2-4 topi donatori riempiranno una piastra da 12 pozzetti. Mantenere le colture in un incubatore umidificato a 37 °C con il 5% di CO2 per 72 ore.
- Controllare visivamente le cellule LN in coltura per l'attivazione a 48 ore e 72 ore. Le cellule attivate formeranno ampi cluster e le cellule T aumenteranno di dimensioni, diventando più pleomorfe. L'aumento del metabolismo causerà un abbassamento del pH nel terreno, passando dalla pesca all'arancione. Se il pH è sufficientemente basso da far ingiallire il terreno, aggiungere 1 mL di MTC fresco per prevenire la tossicità per le cellule nelle restanti 24 ore.
- Procedi per il trasferimento adottivo.
3. Trasferimento adottivo di cellule T patogene specifiche per l'AQP4
NOTA: Questo passaggio segue la Sezione 2.5: Coltura di cellule T e polarizzazione proinfiammatoria delle cellule T.
- Recupera le cellule polarizzate da piastre a 12 pozzetti pipettandole su e giù per rimuoverle e trasferendole in una provetta da 50 mL. Mantenere in ghiaccio fino alle iniezioni.
- Contare le cellule, lavarle due volte in PBS freddo e preparare una sospensione di 1 x 108 cellule/mL in PBS. Generalmente, iniettare le cellule entro un'ora.
- Mescolare delicatamente le cellule facendole roteare e trasferirle in una siringa da 1 ml al momento dell'iniezione. Somministrare 200 μl di cellule (2 x 107) per via endovenosa (e.v.) a ciascun topo, attraverso la vena caudale.
- Iniettare in ciascun topo ricevente i.p. 200 ng di tossina B. pertussis diluita in 200 μL di PBS quel giorno e 2 giorni dopo. Monitorare quotidianamente i topi per segni di malattia clinica.
