Colorazione immunofluorescente di popolazioni neuronali nel tratto gastrointestinale murino embrionale

Abstract

Fonte: Barlow-Anacker, A. J., et al., Immunocolorazione per visualizzare lo sviluppo del sistema nervoso enterico murino. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video dimostra l'immunocolorazione del tratto gastrointestinale murino embrionale per visualizzare e analizzare la distribuzione della popolazione neuronale utilizzando l'immunofluorescenza e la microscopia confocale.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.

1. Protocollo di immunocolorazione

1. Se i campioni sono stati conservati in saccarosio al 30%, sciacquarli 3 volte per 20 minuti in 1x PBS su una piattaforma a dondolo.
2. Posizionare i tratti gastrointestinali nella soluzione bloccante su una piattaforma a dondolo per 1 ora a RT.
3. Rimuovere la soluzione bloccante e incubare i tratti gastrointestinali con la quantità appropriata di anticorpi primari diluiti nella soluzione bloccante per 4 ore a RT o O/N a 4 °C su una piattaforma oscillante. Utilizzare una diluizione 1:1.000 dell'anticorpo umano anti-Hu (siero ottenuto dal paziente), una diluizione 1:1.000 dell'anticorpo della proteina fluorescente verde (GFP) del pollo e una diluizione 1:100 dell'anticorpo anti-ChAT di capra.
   nota: Utilizziamo un anticorpo umano anti-Hu che è stato ottenuto localmente da un paziente; tuttavia, gli anticorpi anti-Hu sono disponibili in commercio, ad esempio l'anti-Hu di topo (da utilizzare con diluizione di 1:500).
4. Sciacquare i tratti gastrointestinali in 1x PBS 3 volte per 5 minuti e poi per 1 ora a RT su una piattaforma a dondolo.
5. Sostituire 1x PBS con anticorpi secondari diluiti 1:500 in soluzione bloccante su una piattaforma oscillante per 4 ore a RT o O/N a 4 °C. Utilizzare coloranti anti-ammina umana d'asino come Dylight, Cy2 anti-pollo d'asino e Cy5 anti-capra d'asino. Se si utilizza l'anticorpo anti-Hu del topo, utilizzare una diluizione 1:500 del colorante reattivo all'ammina di topo d'asino 405.
   nota: L'intensità dell'espressione endogena di GFP e tdTomato e la chiarezza dell'immunocolorazione aumentano con l'età dello sviluppo. In genere sterilizziamo l'intestino embrionale singolarmente in provette da 0,2 ml con 150 μl di soluzione colorante per ridurre il volume degli anticorpi utilizzati e anche per garantire una colorazione efficiente del tessuto.
6. Sciacquare i tratti gastrointestinali in 1x PBS 3 volte per 5 minuti e poi per 1 ora a RT su una piattaforma a dondolo.
7. Posizionare alcune gocce di terreno di montaggio a fluorescenza con DAPI su un vetrino. Immergere il tratto gastrointestinale nel mezzo di montaggio della fluorescenza e aggiungere un vetro di copertura direttamente sopra il tessuto. Il mezzo di montaggio della fluorescenza -G è un composto solubile in acqua che fornisce una tenuta semipermanente.
   nota: Utilizzare un mezzo di montaggio a fluorescenza come Vectashield, un mezzo di montaggio a base di glicerolo che previene lo sbiadimento degli anticorpi e il fotosbiancamento. Entrambi questi prodotti consentono di conservare i tessuti per lunghi periodi di tempo a 4 °C.
8. Acquisisci immagini di ciascun fluoroforo utilizzando un microscopio confocale. Utilizzare le lunghezze d'onda di eccitazione per fluorofori e filtri impiegati nella Tabella 1.
9. Eseguire l'analisi delle immagini assistita da computer utilizzando il software appropriato a seconda del tipo di confocale utilizzato per acquisire le immagini.

Tabella 1: Lunghezze d'onda di eccitazione dell'imaging confocale, fluorofori e filtri. Vengono presentate le lunghezze d'onda di eccitazione, i fluorofori rilevabili e i filtri utilizzati. Queste informazioni possono essere utilizzate nella scelta di combinazioni di anticorpi secondari per l'immunofluorescenza multicolore.

Eccitazione			Emissione
Linea laser	Tipo di fluoroforo	Esempi	Tubo fotomoltiplicatore	Opzioni di filtro
408 nm	blu	Alexa Fluor 405, Cascade Blue, Coumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, la maggior parte dei punti quantici	1	BP 425-475 nm
488 nm	verde	Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calceina, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1	numero arabo	BP 500-550 nm
561 nm	rosso	Alexa Fluor 546, 555, 568 e 594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, Ficoeritrina (PE), Iodio Propidio (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC	3	BP 570-620 nm
638 nm	Rosso Lontano	Alexa Fluor 633 e 647, alloficocianina (APC), Cy5, TO-PRO-3	4	BP 663-738 nm

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina tamponata con fosfato	Ossoide	BR0014G
Albumina sierica bovina	pescatore	BP1605
Triton X-100	sigma	X100
Cannocchiale a fluorescenza	Nikon	Stereoscopio SMZ-18
Provette Eppendorf da 1,5 mL	VWR	Codice 20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, AL	Codice 0100-01
Vetrini	pescatore	12-550-15
Vetro di copertura	VWR	Codice 16004-330
Microscopio confocale	Nikon	Nikon A1
Elementi Nikon	Nikon