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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Modello animale
- Intercross di topi emizigoti Tg(Gfap-luc+/-) (topi transgenici che esprimono luciferasi di lucciola) con topi emizigoti Tg(M83+/-) (topi transgenici che esprimono alfa-sinucleina umana con la mutazione familiare A53T) per generare topi emizigoti bigenici Tg(M83+/-:Gfap-luc+/-).
- Genotipizzare la progenie con la reazione a catena della poliemerasi (PCR) in tempo reale per la presenza del transgene che codifica per l'alfa-sinucleina umana e con la PCR standard per la luciferasi della lucciola.
- Inoculare gli animali a un'età compresa tra le sei e le otto settimane.
2. Preparazione dell'inoculo
- Preparare l'alfa-sinucleina umana ricombinante monomerica con la mutazione A53T nel tampone salino tamponato Tris (TBS) contenente 150 mM di NaCl in 20 mM di Tris-HCl (pH 7,2).
- Preparare l'alfa-sinucleina fibrillare per le inoculazioni agitando 3 μg/μL di alfa-sinucleina umana ricombinante monomerica in un agitatore orbitale a 800 giri/min e 37 °C per 5 giorni.
- Diluire le fibrille in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per raggiungere una concentrazione finale di 1 μg/μL per le inoculazioni intraperitoneali.
- Frammentare le fibrille di alfa-sinucleina con un sonicatore a barra per 1 minuto (40 impulsi della durata di 0,5 s con una pausa di un secondo tra ogni impulso e un'ampiezza impostata al 50%) su ghiaccio. Per evitare la contaminazione da semina incrociata, utilizzare sonde di sonicazione pulite per preparare inoculo diverso.
3. Iniezioni intraperitoneali
- Per le iniezioni intraperitoneali, narcotizzare brevemente gli animali in una camera di anestesia mediante inalazione di isoflurano/ossigeno utilizzando una velocità di flusso di 2 L/min e il vaporizzatore impostato al 2%. Pizzica il dito del piede dell'animale e verifica che non ritiri l'arto posteriore per garantire un'anestesia adeguata.
- Riempire una siringa ipodermica monouso da 27 G con 50 μl di fibrille di alfa-sinucleina sonicata o PBS.
- Iniettare direttamente nel peritoneo del topo ed evitare di penetrare nell'intestino tenue o nel cieco situato dietro la parete addominale tenendo l'animale in posizione dorsale con la testa rivolta lontano dallo sperimentatore e verso il basso a circa 45°. Monitorare gli animali fino a quando non si sono ripresi dall'anestesia.