1. Monitoraggio della diffusione transcellulare di proteine simili ai prioni mediante imaging time-lapse in vivo
NOTA: Coltiva le linee di C. elegans wild-type (WT) (N2) e transgeniche secondo metodi standard e controlla attentamente la temperatura di coltivazione.
- Generare linee transgeniche di C. elegans che esprimono la proteina simile ai prioni, marcate con una proteina fluorescente rossa monomerica (mRFP).
- Preparare popolazioni sincronizzate mediante deposizione delle uova o sbiancamento secondo metodi standard.
- Sincronizzazione tramite deposizione delle uova
- Trasferite 10-20 adulti gravidi su un piatto e lasciateli deporre le uova per 1-2 ore. Togliete gli adulti dal piatto e lasciate crescere la prole fino all'età desiderata.
- Sincronizzazione mediante decolorazione
- Raccogliere una popolazione non sincronizzata di adulti gravidi e candegginarli con una soluzione alcalina di ipoclorito (250 mM di idrossido di sodio (NaOH) e diluizione 1:4 (v/v) di candeggina commerciale in acqua (H2O)). Lavare le uova due volte (218 x g per 1 min) con tampone M9 (21 mM Na2HPO4·7H2O (di-sodio idrogeno fosfato eptaidrato), 22 mM (potassio diidrogeno fosfato) KH2PO4, 86 mM di sodio cloruro (NaCl), 1 mM di MgSO4·7H2O (magnesio solfato eptaidrato), aggiungere dH2O fino a 1 L).
- Lasciarli schiudere nel tampone M9 con una leggera agitazione durante la notte (O/N) a 20 °C. Lo sviluppo dei vermi verrà arrestato allo stadio L1 in assenza di una fonte di cibo, lasciando una popolazione sincronizzata. Trasferire gli L1 su piastre fresche di terreni di crescita per nematodi (NGM) seminate con batteri OP50 E. coli e lasciare che la progenie si sviluppi fino all'età desiderata.
- Preparare tamponi di agarosio al 2% (in H2O) su un vetrino da microscopio come descritto.
- Preparare due vetrini da microscopio con nastro adesivo posizionato su tutta la loro lunghezza da utilizzare come distanziatori. Posizionare un terzo vetrino da microscopio tra di loro.
- Sciogliere il 2% di agarosio in H2O e pipettare una goccia sul vetrino pulito.
- Posizionare un quarto vetrino perpendicolarmente agli altri tre vetrini sopra la goccia di agar. Premerlo delicatamente verso il basso per appiattire il tampone allo stesso spessore del nastro di etichettatura.
- Lasciare asciugare per 1 minuto prima di rimuovere i distanziatori e separare delicatamente le guide. Il tampone di agar si attaccherà a uno di essi.
- Pipettare ~10 μl di anestetico (2 mM di levamisolo in tampone M9) sul tampone e trasferire ~10 animali utilizzando un plettro in filo di platino. Coprire con un vetrino coprioggetto (~22 x 22 mm) e scattare le immagini entro 1 ora.
- In alternativa, per acquisire filmati per un periodo di tempo più lungo o per ridurre ulteriormente la possibilità di qualsiasi movimento degli animali, utilizzare una combinazione di anestetico e immobilizzazione a perline.
- Preparare tamponi di agarosio al 10% (in tampone M9) come descritto e aggiungere vermi a una soluzione standard di dimensioni nanosfere da 3 μl (perle di polistirene, 100 nm) più 3 μl di anestetico (4 mM di levamisolo in tampone M9). Coprire delicatamente con un vetrino coprioggetto. Per evitare l'essiccazione, sigillare il vetrino coprioggetti con VALAP (una miscela di quantità uguali di vaselina, lanolina e cera di paraffina).
- Immagine di vermi immobilizzati utilizzando un microscopio confocale.
NOTA: I risultati sono ottenuti utilizzando un microscopio confocale AF a disco rotante dotato di una fotocamera EM-CCD e un software di automazione della microscopia e analisi delle immagini come MetaMorph che delinea le specifiche di seguito, ma è possibile utilizzare anche altri sistemi di imaging confocale comparabili.
- Utilizzare l'obiettivo a olio 63X o 100X/1.4NA e posizionare il vetrino del microscopio contenente i vermi nel supporto del vetrino del microscopio.
- Apri il software. Regola la potenza del laser e i filtri per l'imaging mRFP. Utilizzare il laser a 561 nm al 10% di potenza e il filtro di emissione >600 nm.
- Aprire "Acquisizione multidimensionale". Nella scheda "Principale", seleziona le caselle "Timelapse" e "Esegui diari" (Messa a fuoco automatica hardware: disattivata).
- Nella scheda "Salvataggio", seleziona o crea la cartella della directory in cui devono essere salvati i file. Assegnare un nome al file.
- Nella scheda "Lunghezza d'onda", seleziona l'illuminazione appropriata e regola l'esposizione e il guadagno. Utilizzare "YokoQuad Red" (o un'impostazione di illuminazione equivalente per l'imaging mRFP) con un'esposizione compresa tra 100 e 300 msec e un guadagno della fotocamera compreso tra 100 e 300, a seconda del singolo campione (valutato utilizzando l'immagine dal vivo).
- Nella scheda "Timelapse", seleziona "Numero di punti temporali" = 301, "Durata" = 5 min e "Tempo/Intervallo" = 1 sec.
- Nella scheda "Diari", selezionare Giornale: "AFC SET Z HOLD" e "AFC Return to Z HOLD", Digitare: "Speciale" (due volte), Punto iniziale: "Inizio del punto temporale" e "Punto finale del tempo". Questa opzione di messa a fuoco automatica è importante per riprendere la stessa sezione per un periodo di tempo più lungo.
- Al termine della configurazione, premere "Acquisisci". Il video timelapse viene salvato come file TIFF separati.
