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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Produzione e purificazione del virus adeno-associato ricombinante (rAAV)
Nota: la produzione e la purificazione del vettore rAAV sono state eseguite dal Leuven Viral Vector Core (LVVC).
- In breve, trasfettare le cellule HEK 293T aderenti a basso passaggio subconfluente (<50) utilizzando una soluzione di trasfezione di NaCl 25kD linear polyethylenimine 150 nM e tre diversi plasmidi in un rapporto di 1:1:1 in DMEM medium 2% fetale siero bovino. Dopo 24 ore di incubazione a 37 °C in un acido CO2 al 5%, sostituire il terreno con un siero fetale bovino fresco DMEM medium al 2%.
nota: I plasmidi includono i costrutti per il sierotipo AAV7, il plasmide di trasferimento AAV che codifica per l'alfa-sinucleina umana mutante A53T (α-SYN) sotto il controllo del promotore della sinapsina1 potenziato da CMVie e il plasmide helper adenovirale pAdvDeltaF6.
- Raccogliere il terreno 5 giorni dopo la trasfezione transitoria e concentrarlo utilizzando la filtrazione a flusso tangenziale.
- Purificare le particelle vettoriali rAAV dal mezzo concentrato utilizzando un gradiente a gradini di iodixanolo.
- Utilizzare tecniche standard di PCR in tempo reale per la determinazione della copia genomica (GC). In questo protocollo, un titolo vettoriale di 3,0 E11 GC/ml è stato utilizzato per sviluppare un modello di ratto basato su α-SYN per la malattia di Parkinson (PD).
2. Iniezione stereotassica del vettore rAAV α-SYN nella substantia nigra (SN) del Ratto (Figura 1)
- Ospita ratti Wistar femmine di otto settimane del peso di circa 200-250 g in un normale ciclo luce/buio di 12 ore con libero accesso al cibo pellettato e all'acqua del rubinetto.
- Sottoporre il ratto ad anestesia intraperitoneale (i.p.) contenente una miscela di ketamina (60 mg/kg) e medetomidina (0,4 mg/kg). Una volta che il ratto è anestetizzato e non reagisce quando stringe le diverse zampe, somministrare un micro-transponder per via sottocutanea sulla schiena del ratto per un ulteriore riconoscimento utilizzando un impiantatore di micro-transponder. Verificare che il micro-transponder sia posizionato correttamente e possa essere letto dal dispositivo di lettura.
- Taglia i capelli sulla parte superiore del cuoio capelluto. Applicare un anestetico locale sia sul cuoio capelluto che sulle orecchie. Eseguire il resto della procedura chirurgica sotto un flusso laminare utilizzando tecniche asettiche.
- Posiziona i ratti in un telaio stereotassico per la testa usando due barre auricolari, una bocca e una barra per il naso. Copri il corpo del ratto con una coperta di carta per evitare un calo della temperatura corporea. Applicare un lubrificante oculare per evitare che gli occhi si secchino.
- Disinfettare il cuoio capelluto con jodium 1% in isopropanolo 70% e praticare una piccola incisione nella linea mediana del cuoio capelluto. Raschiare delicatamente le membrane del cranio e risciacquare con soluzione fisiologica. Lascia asciugare il teschio per diversi minuti. Osservare le suture craniche e i due punti di riferimento: Bregma e Lambda.
- Per iniettare il vettore rAAV nel SN, definire le coordinate verso Bregma (anteroposteriore: 5,3 mm; mediolaterale: 2,0 mm; e dorso-ventrale: 7,2 mm calcolate dalla dura).
nota: Le coordinate tridimensionali per ogni regione di interesse possono essere calcolate utilizzando un atlante stereotassico del cervello di ratto, applicando Bregma come punto di riferimento anatomico.
- Riempire una siringa per microiniezione da 10 μl (calibro 30 da 20 mm) con il vettore rAAV e inserirla nello strumento stereotassico collegato a una pompa di microiniezione motorizzata. Controllare il volume rilasciando una goccia di vettore ed eliminare in un detergente polivalente pH 9 (es. RBS).
- Controllare visivamente se la testa è fissata diritta nel telaio della testa e valutare l'asse sinistra-destra. Definire visivamente attentamente le coordinate anteroposteriore e mediolaterale per Bregma e Lambda e misurare la loro altezza utilizzando un ago da 20 mm calibro 30 nel braccio dorso-ventrale del telaio stereotassico.
- Lasciare un dislivello massimo di 0,3 mm tra Bregma e Lambda. Riposizionare l'ago su Bregma e applicare le coordinate anteroposteriore e mediolaterale spostando il braccio anteroposteriore e il braccio mediolaterale del telaio stereotassico.
- Nel punto di iniezione, misurare l'altezza del cranio e assicurarsi che non differisca più di 0,3 mm dall'altezza di Bregma. Praticare un foro nel cranio con un diametro di circa 2 mm. Misura l'altezza della dura, che servirà come riferimento per l'applicazione della coordinata dorso-ventrale. In alternativa, sottrarre uno spessore fisso per il cranio (0,9 mm).
- Penetrare la dura madre con un ago calibro 26 e assorbire il sangue con tessuto sterile. Attendere che tutto il sanguinamento si sia fermato prima di procedere.
- Inserire lentamente la siringa per microiniezione da 10 μl precaricata con soluzione vettoriale nel cervello alla profondità predeterminata (coordinata dorso-ventrale). Attendere 1 minuto con l'ago in posizione. Iniettare 3 μl di soluzione vettoriale (3,0 copie del genoma E11/ml (dose media del vettore) o 1,0 E12 GC/ml (dose alta del vettore) di rAAV2/7 α-SYN o vettore di controllo eGFP) utilizzando la pompa di microiniezione motorizzata con una portata di 0,25 μl/min.
- Dopo l'iniezione, tenere l'ago in posizione per altri 5 minuti prima di rimuoverlo lentamente. Cucire il cuoio capelluto utilizzando poliestere intrecciato rivestito 3.0, disinfettare con jodio all'1% in isopropanolo al 70% e rimuovere delicatamente l'animale dallo strumento stereotassico. Allentare prima la barra del naso e della bocca, quindi le due barre auricolari.
- Per invertire l'anestesia, iniettare nel ratto per via intraperitoneale 0,5 mg/kg di atipamezolo e posizionare il ratto in una gabbia pulita su una piastra riscaldante a 38 °C fino al risveglio. Copri il ratto con una coperta di carta per evitare un calo della temperatura corporea.
- Fornire un facile accesso a cibo e acqua per le prime ore. Monitora il ratto per i primi giorni. Se necessario, applicare analgesia.
nota: Non è necessario rimuovere i punti dal cranio. Dopo 1-2 settimane il cranio è completamente riparato e i punti di sutura si allentano.
