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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Omogeneizzazione e frazionamento
- Selezione tissutale
NOTA: Sono stati selezionati il tessuto congelato della corteccia frontale post-mortem dal controllo sano (Ctl) e i casi di AD patologicamente confermati (n=2). La valutazione neuropatologica post-mortem della distribuzione della placca amiloide è stata eseguita secondo i criteri di punteggio semi-quantitativi del Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease, sebbene la patologia del groviglio neurofibrillare sia stata valutata in conformità con il sistema di stadiazione di Braak.
- Ottenere tessuto cerebrale post-mortem congelato da casi di controllo sano (Ctl) e AD patologicamente confermati. Utilizzando contenitori di ghiaccio secco, pinze e una lama di rasoio, asportare ~ 250 mg di porzioni di materia grigia da ciascun campione di tessuto su barche di pesatura usa e getta catramate, facendo attenzione a prevenire lo scongelamento del tessuto. Registrare il peso di ogni pezzo da omogeneizzare.
- Asportare ~ 250 mg di materia grigia utilizzando pinze e rasoio ispezionando visivamente per individuare l'interfaccia tra la materia grigia esterna e la sostanza bianca interna. Evita la sostanza bianca e, soprattutto, i grandi vasi sanguigni o le regioni sanguinolente, le meningi o le aracnoidee. Mantenere il tessuto congelato durante il processo di taglio lavorando rapidamente e frequentemente, posizionando la barca di pesatura con il tessuto cerebrale in contenitori di polistirolo con ghiaccio secco.
- Registrare il peso esatto della materia grigia asportata da ciascun pezzo congelato utilizzando una bilancia analitica. Calcolare il volume di tampone a basso contenuto di sale (LS) (vedere Tabella 1) necessario per l'omogeneizzazione a dencino (5 mL/g o 20% p/v).
- Preparare 10 ml di tampone LS con 1x cocktail di proteasi e inibitori della fosfatasi e raffreddare con ghiaccio.
- Rimuovere il fazzoletto pesato e la barca per pesare dal ghiaccio secco e tagliarli a dadini in pezzi di circa 2 x 2 mm man mano che si scongelano. Trasferire in una provetta dounce omogeneizer pre-raffreddata da 2 ml su ghiaccio.
- Aggiungere 5 ml/g (20% p/v) di tampone a basso contenuto di sale (LS) ghiacciato con 1X cocktail di proteasi e inibitori della fosfatasi.
- Omogeneizzare il tessuto cerebrale sul ghiaccio utilizzando circa 10 colpi di pestello ad alta distanza A e 15 colpi di pestello a bassa distanza B.
- Trasferire tutto l'omogeneizzato in una provetta di polipropilene da 2 mL utilizzando una pipetta di vetro Pasteur. Etichettare la provetta con "TH" (Total Homogenate), il numero della confezione del tessuto e il volume dell'omogeneizzato. Aliquotare 0,8 mL in una provetta da 1,5 mL etichettata. L'eventuale omogeneizzato in eccesso può essere aliquotato in modo analogo e conservato a -80 °C.
- A ciascuna aliquota da 0,8 mL, aggiungere 100 μL ciascuno di NaCl 5 M e sarkosil al 10% (p/v) a concentrazioni rispettivamente di 0,5 M e 1% p/v. Mescolare bene le provette per inversione e incubare con ghiaccio per 15 minuti. Etichettare le provette con "TH-S" (Total Homogenate-Sarkosyl) per indicare che gli omogeneizzati sono in sarkosil-tampone (Tabella 1).
- Sonicare ogni tubo per tre impulsi di 5 s al 30% di ampiezza sul ghiaccio (intensità massima = 40%) utilizzando una sonda a micropunta.
- Determinare le concentrazioni proteiche degli omogeneizzati utilizzando il metodo del saggio dell'acido bicinchoninico (BCA).
nota: La concentrazione proteica media degli omogeneizzati di TH-S preparati a 5 mL LS per grammo di tessuto è di 15-20 mg/mL. Gli omogeneizzati possono essere frazionati immediatamente o conservati a -80 °C fino al momento dell'uso.
- Diluire gli omogeneizzati di TH-S a 10 mg/mL utilizzando un tampone sark ghiacciato (Tabella 1) con 1x inibitori della proteasi e della fosfatasi.
- Trasferire 5 mg di proteine (0,5 mL) di ciascun omogenato TH-S in provette per ultracentrifuga in policarbonato da 500 μL e bilanciare a coppie con sark-buffer. Caricare le provette in un rotore pre-raffreddato e in un'ultracentrifuga a 180.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Trasferire i surnatanti solubili in sarkosili (S1) in provette da 1,5 mL e conservare a -80 °C.
NOTA: (lavaggio opzionale) Aggiungere 200 μl di sark-buffer alle provette per ultracentrifuga contenenti le frazioni insolubili per detergente (P1) e rimuovere i pellet (P1) dal fondo delle provette per ultracentrifuga utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl.
- Far girare brevemente le provette invertite per 2-3 s (≤2.500 x g) su una microcentrifuga per trasferire i pellet (P1) e il tampone nelle provette da 1,5 mL sottostanti. Risospendere i pellet insolubili (P1) nel sark-buffer pipettandoli su e giù per assicurarsi che il pellet venga interrotto.
- Bilanciare in coppia e centrifugare a 180.000 x g per altri 30 minuti a 4 °C.
- Scartare il surnatante di lavaggio opzionale (S2) e incubare i pellet insolubili in sarkosilio (P2) in 50-75 μL di tampone ureico (Tabella 1) con 1x PIC (cocktail di inibitori della proteasi e della fosfatasi) per 30 minuti a temperatura ambiente per solubilizzare il pellet.
nota: Scaldare il tampone di urea a temperatura ambiente prima dell'uso per evitare precipitazioni di SDS. Per le applicazioni sensibili ai detergenti, omettere la SDS dal tampone ureico e considerare il lavaggio del pellet insolubile (P2) in tampone a basso contenuto di sale prima di risospendere nel tampone ureico.
- Trasferire i pellet risospesi (P2) in provette da 0,5 mL e utilizzare una breve sonicazione con micropunte (1 s) al 20% di ampiezza (intensità massima = 40%) per solubilizzare completamente i pellet.
- Determinare le concentrazioni proteiche delle frazioni sarkosilsolubili (S1) e insolubili (P2) utilizzando il metodo del saggio BCA. Utilizzare queste frazioni immediatamente o conservare a -80 °C fino al momento dell'uso.
Tabella 1: Elenco dei buffer
| Soluzione di sarkosil al 10% p/v: 10 g di sale sodico N-lauril-sarcosina per 100 ml di ddH2O (agitare a RT per una notte) |
| Tampone a basso contenuto di sale (LS): 50 mM HEPES pH 7.0, 250 mM saccarosio, 1 mM EDTA |
| Tampone Sarkosyl (sark): tampone LS + 1% (p/v) sarkosyl + 0,5 M NaCl |
| Tampone urea (conservare a -20 °C): 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 8M urea, 2% SDS |