Valutazione della funzione motoria in un modello murino sperimentale di neurite autoimmune

Abstract

Fonte: Gonsalvez, D. G., et al., Un approccio semplice per indurre neurite autoimmune sperimentale nei topi C57BL/6 per valutazioni funzionali e neuropatologiche. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video dimostra il processo di valutazione della disfunzione motoria in un modello murino attraverso la somministrazione della tossina della pertosse e di un inoculo contenente peptidi e adiuvanti che imitano la mielina, seguiti da test su tapis roulant per valutare la funzione motoria e valutare il danno nervoso risultante dovuto all'attivazione immunitaria e alla demielinizzazione.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Induzione EAN (neurite autoimmune sperimentale)

NOTA: L'EAN può essere indotto con successo nei topi maschi C57BL/6 di età compresa tra 6-8 settimane. Il protocollo di induzione dura complessivamente 9 giorni. Il giorno 0 si riferisce al giorno della prima immunizzazione. Per questo protocollo, le iniezioni sono state condotte in anestesia (vedere il passaggio 1.1.2 di seguito).

1. Il giorno -1:
   1. Preparare la soluzione di tossina della pertosse (vedere la Tabella dei materiali) da 1,6 μg/mL utilizzando soluzione salina sterile tamponata con fosfato isotonico di topo 0,1 M (MT-PBS).
   2. Anestetizzazione con isoflurano:
      1. Posizionare il topo (C57BL/6, maschio, 6-8 settimane) nella camera di anestesia e regolare il flusso di ossigeno a 1 L/min.
      2. Accendi il vaporizzatore di isoflurano, regolalo al 2,5% per l'anestesia, monitora la respirazione e attendi 2 minuti o fino a quando i riflessi primari (corneale e arto posteriore) non rispondono più.
   3. Rimuovere il topo dalla camera di anestesia e somministrare 250 μl della suddetta soluzione di tossina pertosse tramite un'iniezione intraperitoneale (i.p.) utilizzando una siringa da 0,5 ml con un ago da 30_1/2 G.
   4. Preparare l'inoculo iniettabile per l'immunizzazione:
      1. Preparare la soluzione A utilizzando una soluzione di 2 mg/mL di peptide P0180-199 (con purezza > 98%, sequenza S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in soluzione fisiologica allo 0,9%.
      2. Preparare la soluzione B utilizzando una soluzione di 20 mg/mL di Mycobacterium tuberculosis (vedere la Tabella dei materiali) nell'adiuvante completo di Freund (FCA, comprendente il 15% di monoolato di mannide + l'85% di olio di paraffina e 0,5 mg/mL di Mycobacterium butyricum essiccato, ucciso ed essiccato).
      3. Per preparare l'inoculo finale per l'iniezione, unire parti di uguale volume delle soluzioni A e B in una frusta a perline e mescolarle alla massima velocità per 1 minuto a temperatura ambiente.
         nota: Le soluzioni A e B possono essere conservate come scorte e conservate a 4 °C per un massimo di un mese, ma l'inoculo finale combinato deve essere preparato al momento il giorno dell'iniezione nel topo.
2. Il giorno 0, somministrare 50 μl di inoculo (preparazione descritta al punto 1.1.4) in un topo tramite un'iniezione sottocutanea utilizzando un ago da 23 G.
   nota: L'iniezione può essere posizionata tra le scapole o tra l'arto posteriore e la coda sopra il dorso caudale.
3. Il giorno 1, preparare la soluzione di tossina della pertosse di 1,2 μg/mL (in MT-PBS) e somministrare 250 μL in un topo tramite iniezione endovenosa utilizzando una siringa da 0,5 mL con un ago da 301/2 G.
4. Il giorno 3, ripeti il passaggio 1.3 sopra.
   nota: Le soluzioni madre A e B possono essere preparate e conservate a 4 °C per un massimo di un mese. Tuttavia, l'inoculo iniettabile finale, prodotto combinando le soluzioni madre A e B, deve essere effettuato il giorno dell'iniezione.
5. Il giorno 8, somministrare 50 μl di inoculo (preparazione descritta al punto 1.1.4) in un topo tramite iniezione sottocutanea (vedere il passaggio 1.2 sopra) nello stesso sito di iniezione del passaggio 1.2 (per ciascun animale)

2. Valutazione della funzione motoria

NOTA: Le prestazioni motorie vengono valutate in parallelo con il punteggio clinico per la stessa coorte di animali. L'apparecchio per la valutazione della funzione motoria deve essere collegato a un computer su cui è installato un sistema di imaging della funzione del cammino (vedere la Tabella dei materiali). Si raccomanda inoltre che tutti i topi da valutare siano abituati all'attività di corsa prima dell'induzione EAN. A tal fine, le prove (2 test per topo) vengono eseguite tre giorni prima dell'induzione della malattia (giorno -3).

1. Accendere l'apparecchio di valutazione del funzionamento del motore e accendere il pulsante della luce.
2. Posiziona saldamente il mouse e inchiostragli le zampe abbassandolo su un contenitore pieno di inchiostro rosso mentre tieni la coda.
   nota: Questo passaggio è necessario per il ceppo C57BL/6, ma può essere saltato se viene utilizzato un ceppo di topo con un colore del mantello bianco.
3. Posizionare il mouse nel vano di camminata e impostare la velocità del tapis roulant a 15 cm/s.
4. Accendere il tapis roulant e fare clic sul pulsante "registra" per acquisire il movimento di corsa del mouse utilizzando il sistema di imaging della funzione di deambulazione (vedere Tabella dei materiali).
5. Usa un timer e misura ogni corsa per 36 s. Dopo 36 s, interrompere la registrazione e arrestare il tapis roulant.
   nota: I mouse che non riescono a completare correttamente l'attività in esecuzione per questo intervallo di 36 secondi sono considerati non riusciti.
6. Salva il file video nella cartella designata.
7. Ripetere i passaggi precedenti per ogni mouse da valutare. Metti alla prova i mouse con la stessa attività in esecuzione ogni 3 giorni.
8. Analizza i file video modificati utilizzando il software per i parametri della funzione di andatura (vedi Tabella dei materiali).
   nota: I dettagli su come analizzare i diversi parametri del motore variano da software a software, quindi fare riferimento alle istruzioni del produttore prima dell'analisi. A seconda degli obiettivi specifici della ricerca, i tessuti animali possono essere prelevati in qualsiasi fase della valutazione della funzione post-motoria per ottenere prove istologiche di danno assonale e mielinale tramite immunoistochimica o microscopia elettronica.

Results

Tabella 1: Paradigma del punteggio clinico EAN.

Punteggio	Criteri	Note e commenti sui criteri di valutazione
0	Mouse normale
1	Meno vivace Tornio OR	Questo viene valutato in rispo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, maschio, 6-8 settimane	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Tossina della pertosse	Elenco Laboratori Biologici, Inc., CA, Stati Uniti	#181
0,1 M di fosfato isotonico di topo tamponato salino (MT-PBS)			I laboratori avranno il proprio protocollo.
Isoflurano	Pharmachem, QLD, Australia		I laboratori avranno il proprio protocollo per la somministrazione.
peptide P0180–199	Wuxi Nordisk Biotech Co. Tenente SHG, CHN		P0180–199, sequenza S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Mycobacterium tuberculosis ucciso dal calore (ceppo H37RA)	Difco, MI, Stati Uniti	#231141
Coadiuvante completo di Freund (FCA)	Difco, MI, Stati Uniti	#263910
16% Paraformaldeide (PFA)	Servizi di microscopia elettronica	#15710	Diluire al 4% di PFA il giorno della raccolta dei tessuti.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Diluire al 2,5% di glutaraldeide il giorno di fissazione.
Aziduro di sodio	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Crea il 10% (p/v) di stock in 0,1 milioni di MT-PBS. Utilizzare allo 0,03% (v/v).
saccarosio	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Utilizzare al 30% (p/v).
Temperatura di taglio ottimale (OCT) media	Sakura Finetek, CA, Stati Uniti	#4583
Siero d'asino normale	Merck Millipore, MA, Stati Uniti	#S30-100	Utilizzare come diluente anticorpale al 10% (v/v) o altra concentrazione determinata dal proprio laboratorio.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, Stati Uniti	#90o2-31-1	Utilizzare in diluente anticorpale allo 0,3% (v/v) o altra concentrazione determinata dal proprio laboratorio.
Proteina precursore anti-amiloide di coniglio (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, Stati Uniti	S12700	Utilizzato in scala 1:400 o titolato nel proprio laboratorio.
Proteina-1 associata alla contactina di coniglio (Caspr)	Dono del Prof. Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israele		Utilizzato in scala 1:500 o titolato nel proprio laboratorio.
Anticorpi secondari coniugati Alexa Fluor appropriati	Sonde molecolari (Life Technologies), OR, USA	diverso	Utilizzare in scala 1:200 o titolare nel proprio laboratorio. La scelta della specie in cui è stato allevato l'anticorpo e di Alexa Fluor è a discrezione di ciascun laboratorio.
Soluzione di montaggio acquosa	Dako (Agilent), CA, Stati Uniti	#S3023	Ogni laboratorio avrà le proprie preferenze.
attrezzatura
Siringa da 0,5 ml con aghi da 301/2 g	Bd	#326105
Ferri da 23 g	Bd	#305143
Tampone d'inchiostro rosso			Qualsiasi tampone di inchiostro rosso o colorante alimentare rosso poteva essere utilizzato per segnare le zampe degli animali.
Apparecchio DigiGate (incluso tapis roulant)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Sistema di imaging DigiGate	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Cronometro			È possibile utilizzare qualsiasi timer.
Software DigiGait 8	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Microscopio da dissezione	Zeiss		È possibile utilizzare qualsiasi microscopio da dissezione appropriato.
Scivoli carichi	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Può essere utilizzato qualsiasi cirostato adatto.
Apparecchiature di perfusione e strumenti di dissezione			I laboratori avranno i propri protocolli di perfusione.
Camera umificata opaca			I laboratori possono produrne uno proprio utilizzando un contenitore di plastica opaco.
PAP pene	GeneTex (Stati Uniti)		La cera, la matita o la tensione superficiale possono anche essere utilizzate per creare un pozzo attorno alla sezione del tessuto.
Microscopio confocale	Zeis LSM780		È possibile utilizzare qualsiasi microscopio confocale con linee laser appropriate.
FIJI/Immagine J	Istituti Nazionali di Sanità		Disponibile da www.fiji.sc