Imaging e quantificazione di aggregati proteici in cervelli di Drosophila geneticamente modificati

Abstract

Fonte: Donnelly, K. M., et al. Monitoraggio della trasmissione da cellula a cellula di aggregati proteici simili ai prioni in Drosophila melanogaster. (2018)

Questo video dimostra l'imaging e la quantificazione di aggregati proteici in cervelli di Drosophila geneticamente modificati. I cervelli vengono fissati, lavati e trattati con un agente antisbiadimento prima del montaggio. Le immagini vengono acquisite utilizzando un microscopio confocale e quantificate per osservare la trasmissione di aggregati proteici mutanti.

Protocol

1. Accoppiamento dell'espressione del transgene Htt mediata da Gal4 e QF in Drosophila

1. Raccogliere e/o generare linee transgeniche di Drosophila melanogaster contenenti "driver" Gal4 o QF tessuto-specifici, nonché linee contenenti transgeni Htt wild-type o mutanti a valle del Gal4-UAS o QF-QUAS. Assicurarsi che le proteine espresse da questi transgeni siano fuse con proteine fluorescenti o marcate con epitopi per consentire la differenziazione dei prodotti transgenici Htt mutanti e wild-type nello stesso moscerino. Vedere Figura 1.
   NOTA: Di solito usiamo frammenti dell'esone 1 del gene Htt umano. Tuttavia, le mosche....

Results

Figura 1. Un approccio genetico per l'espressione accoppiata di transgeni Htt mutanti e wild-type utilizzando i sistemi di espressione binaria QF-QUAS e Gal4-UAS. Nella "cellula A", la proteina Htt mutante marcata con mCherry contenente un tratto polyQ di lunghezza patogena (Q91) è espressa utilizzando un driver QF situato a valle di un promotore tessuto-specifico A ("PA"). Nella "cellula B", un Htt .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10X, pH 7,4	ThermoFisher Scientifico	AM9625	Diluire a 1X
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-1L
Salviette Kimwipes	Thomas Scientific	Codice 2904F24
20% paraformaldeide (PFA)	Scienze della microscopia elettronica	15713-S
Siero di capra normale (NGS), filtrato	Laboratori Biologici Lampire	Codice 7332500	Aliquotare e congelare al ricevimento
Pollo anti-GFP	Laboratori Aves	GFP-1020	Utilizzare a diluizione 1:500
Coniglio anti-DsRed	Clontech	632496	Utilizzo a diluizione 1:2000; è in grado di riconoscere proteine fluorescenti a base di DsRed (es. mCherry, mStrawberry, tdTomato, ecc.)
Mouse anti-Bruchpilot	Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi	NC82	Utilizzare a diluizione 1:100; etichetterà le strutture presinaptiche attive in tutto il cervello del moscerino
FITC anti-pollo	ThermoFisher Scientifico	SA1-7200	Utilizzare a diluizione 1:250
Alexa Fluor 568 anti-coniglio	Tecnologie per la vita	Codice: A11011	Utilizzare a diluizione 1:250
Alexa Fluor 647 anticorpo anti-topo	Tecnologie per la vita	Codice A21235	Utilizzare a diluizione 1:250
Reagente antisbiadimento Slowfade Gold	Tecnologie per la vita	S36936
Vetrini per microscopio (25 x 75 x 1,0 mm)	Fisher Scientifico	12-550-143
Vetro di copertura (22 x 22 mm)	Globo scientifico	Anno 1404-15
Pinze Dumont per Biologia Grade, Stile 3	Ted Pella	503	Utilizzo in mano non dominante
Pinza Dumont per Biologia Grade, Stile 5	Ted Pella	505	uso nella mano dominante
Software di analisi delle immagini LAS X	Leica
Software di analisi delle immagini Imaris	Piano bit