1. Accoppiamento dell'espressione del transgene Htt mediata da Gal4 e QF in Drosophila
- Raccogliere e/o generare linee transgeniche di Drosophila melanogaster contenenti "driver" Gal4 o QF tessuto-specifici, nonché linee contenenti transgeni Htt wild-type o mutanti a valle del Gal4-UAS o QF-QUAS. Assicurarsi che le proteine espresse da questi transgeni siano fuse con proteine fluorescenti o marcate con epitopi per consentire la differenziazione dei prodotti transgenici Htt mutanti e wild-type nello stesso moscerino. Vedere Figura 1.
NOTA: Di solito usiamo frammenti dell'esone 1 del gene Htt umano. Tuttavia, le mosche transgeniche possono invece essere generate per esprimere frammenti di Htt più lunghi o altri geni, se lo si desidera.
- Pianificare la strategia genetica in modo tale che i transgeni Htt mutanti e wild-type siano espressi in popolazioni cellulari distinte e non sovrapposte.
- Se si verifica una sovrapposizione di espressione, le proteine Htt mutanti e wild-type sintetizzate nelle stesse cellule si co-aggregano e impediscono il rilevamento di eventi simili ai prioni. Per evitare ciò, utilizzare i repressori specifici Gal4 e QF, rispettivamente Gal80 e QS40 (Figura 1). La selezione di driver Gal4 e/o QF controllati dallo sviluppo può aiutare a limitare l'espressione di Htt mutante alle cellule post-mitotiche, eliminando la possibilità che la divisione cellulare possa contribuire alla diffusione degli aggregati cellula-cellula.
- Utilizzando le condizioni di coltura standard, accoppiare i moscerini per generare una progenie che esprime Htt mutante tramite QF (o Gal4) in una popolazione di cellule "donatrici" e Htt wild-type tramite Gal4 (o QF) in una popolazione di cellule "riceventi". Vedere la Figura 1 per uno schema che mostra una possibile combinazione genetica.
nota: I driver QF e Gal4 che sono stati utilizzati per generare i dati mostrati nelle Figure 1-4 e nella nostra precedente pubblicazione includono il driver del neurone del recettore olfattivo (ORN) DA1, Or67d-QF, e il driver pan-gliale, repo-Gal4.
- Generare mosche di controllo in parallelo che esprimono Htt wild-type in entrambe le popolazioni cellulari marcate con QF e Gal4.
- Raccogliere la progenie del genotipo desiderato e invecchiare gli animali in modo appropriato.
2. Micro-dissezione e fissazione del cervello adulto di Drosophila
NOTA: Questa procedura di dissezione è stata modificata da una pubblicazione precedente e può essere utilizzata per preparare i cervelli per l'imaging di segnali di fluorescenza diretta da fusioni di proteine fluorescenti Htt.
- Raccogliere i seguenti materiali e metterli su ghiaccio: soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,03% di Triton X-100 (PBS/T); provette per microcentrifuga contenenti 970 μl di soluzione fissativa di paraformaldeide (PFA) al 4% preparata aggiungendo 200 μl di PFA al 20% a 770 μl di pbs/t; una capsula di vetro trasparente contenente pozzetto; una pipetta di trasferimento monouso; due pinze da dissezione (una n. 3 e una n. 5).
- Anestetizzare le mosche adulte usando CO2 e trasferirle in un pozzetto della ciotola di vetro con ghiaccio.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento, aggiungere una piccola quantità (~ 500 μL) di PBS/T freddo al pozzetto contenente le mosche e a un pozzetto vuoto. Evita di introdurre troppe bolle, in quanto possono interferire con la dissezione.
- Posizionare il piatto di vetro su una superficie piana sotto un microscopio da dissezione e regolare l'ingrandimento fino a quando il corpo della mosca non riempie il campo visivo ed è a fuoco.
- Posiziona un paio di fonti di luce a collo d'oca in modo che la luce illumini entrambi i lati del piatto di vetro. Ancorare un fazzoletto di laboratorio piegato sotto la capsula di vetro per scartare parti del corpo/cuticole durante la dissezione.
- Usando la pinza n. 3 nella mano non dominante, trasferire una singola mosca nel pozzetto contenente PBS/T. Immobilizzare la mosca afferrando il suo addome con il lato ventrale rivolto verso l'alto.
- Mantenendo la mosca completamente immersa in PBS/T, rimuovere la testa della mosca con la pinza n. 5 nella mano dominante. Inserire una punta di queste pinze sotto la cuticola nel piccolo spazio adiacente alla proboscide su un lato della testa della mosca. Fissare la presa sulla testa pizzicando la pinza per afferrare l'occhio da entrambi i lati.
- Rimuovere la testa della mosca dal suo corpo separando le due pinze. Smaltire il corpo della mosca su un fazzoletto di laboratorio posizionato nelle vicinanze. Mantenere la pressione sulla pinza della mano dominante in modo che la testa della mosca non vada persa.
- Posizionare una punta della pinza n. 3 nella mano non dominante nello stesso piccolo spazio sotto la cuticola dall'altra parte della proboscide. Una volta posizionato, pizzica la pinza per afferrare gli occhi nella stessa posizione su entrambi i lati della testa.
- Una volta che la presa sulla cuticola è sicura, separare delicatamente la pinza a 180°. Questa azione romperà la cuticola della testa senza danneggiare il cervello. Gettare i residui di cuticola su un fazzoletto di laboratorio.
- Sebbene ideale, la cuticola della testa potrebbe non essere completamente rimossa in un solo passaggio. In questo caso, rimuovere la cuticola pezzo per pezzo fino a quando il cervello non è completamente esposto. Fare attenzione a non danneggiare il cervello evitando il contatto diretto con il forcipe.
- Rimuovere il cervello sezionato dal PBS/T afferrando una trachea attaccata o aspirando il cervello nello spazio tra le punte del forcipe mediante azione capillare.
nota: La rimozione della trachea è facoltativa, in quanto tende a non oscurare i lobi antennali sulla superficie anteriore del cervello dove tipicamente immaginiamo. Tuttavia, se la trachea interferisce con l'imaging, rimuoverli con cura in modo che il cervello non venga danneggiato da questa manipolazione.
- Trasferire il cervello di mosca in una delle provette da microcentrifuga contenenti una soluzione fissativa su ghiaccio. Assicurarsi che il cervello si stacchi dalla pinza e sia immerso nella soluzione fissativa.
- Una volta che tutti i cervelli sono stati sezionati, sottoporli a un "short-fix" posizionando i tubi chiusi su un nutatore per ~ 5 minuti a temperatura ambiente al buio.
NOTA: Questa breve fase di fissazione assicura che i cervelli siano più facili da maneggiare nelle fasi successive e non aderiscano ai lati della provetta della microcentrifuga.
- Rimuovere la maggior parte della soluzione fissativa con una pipetta P1000 e gettarla.
- Evitare di aspirare il cervello dal tubo durante questa e qualsiasi successiva fase di lavaggio. Impostare il P1000 su un volume inferiore (ad es. 650 μL) e rimuovere il surnatante in due passaggi. Inoltre, tenere le provette della microcentrifuga in linea con una fonte di luce (ad es. luci dall'alto) durante l'aspirazione per visualizzare meglio il cervello.
- Aggiungere 1 mL di PBS/T fresco al cervello. Lavare rapidamente (< 1 min) al buio, aspirare il surnatante dal cervello e gettarlo.
- Ripetere il lavaggio con PBS/T al buio a temperatura ambiente secondo il seguente programma: 2 lavaggi rapidi (< 1 min), 1 X 5 min, 3 X 20 min e 1 X 1 h di lavaggio. Fissare le parti superiori delle provette per microcentrifuga e posizionare le provette su un nutatore tra un lavaggio e l'altro.
- Se si desidera la colorazione DAPI, sostituire il lavaggio finale di 1 ora con 1 X 30 minuti di incubazione con 250 ng/mL di DAPI diluito in PBS/T, seguito da 2 lavaggi rapidi e 1 X 20 minuti.
- Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere la maggior parte del surnatante tampone di lavaggio, facendo attenzione a non disturbare il cervello, e aggiungere 30 μl di reagente antifade a base di glicerolo al cervello. Incubare a 4 °C al buio senza movimento per almeno 1 ora e fino a 24 ore.
3. Montaggio dell'intero cervello
- Posizionare un vetrino da microscopio in vetro sotto un microscopio da dissezione ed etichettarlo con le informazioni identificative.
NOTA: In alternativa, i cervelli possono essere montati direttamente su un vetro di copertura per accedere a entrambi i lati del cervello durante l'imaging. Un protocollo che descrive questa procedura di montaggio è stato precedentemente pubblicato45.
- Rimuovere i cervelli da ciascuna provetta per microcentrifuga utilizzando una punta di pipetta smussata (preparata utilizzando una lama di rasoio per rimuovere il fondo ~ 1 cm da una punta da 1-200 μL) e trasferirli al centro del vetrino. Trasferire il meno possibile il reagente antisbiadimento con il cervello.
- Utilizzare una pinza per posizionare il cervello nell'orientamento desiderato (ad esempio, dorsale rivolto verso la parte superiore del vetrino e la superficie anteriore rivolta verso l'alto per l'imaging del lobo antennale). Quando si orientano i cervelli, considerare il percorso della luce del microscopio da utilizzare per l'imaging.
- Rimuovere il reagente anti-dissolvenza in eccesso dal vetrino utilizzando l'angolo appuntito di un tessuto di laboratorio piegato senza disturbare il cervello. Lascia riposare il vetrino per ~ 5-10 minuti al buio per consentire al cervello di aderire al vetrino.
- Circondare i cervelli di mosca con quattro piccoli pezzi di vetro di copertura rotto posti su ciascun lato dei cervelli per formare un quadrato di ~ 19 mm x 19 mm. Posizionare un bordo di un vetro di copertura n. 1,5 di 22 mm x 22 mm appena fuori da uno di questi piccoli pezzi di vetro e abbassare delicatamente il vetrino coprioggetti sui cervelli per completare il montaggio a ponte.
- Erogare lentamente un nuovo reagente antisbiadimento per riempire la superficie sotto il vetrino coprioggetti, facendo attenzione a non disturbare il vetrino coprioggetti o il cervello. Rimuovere l'eccesso di antisbiadimento utilizzando l'angolo appuntito di un fazzoletto da laboratorio piegato senza entrare direttamente in contatto con il vetrino coprioggetti.
- Aggiungi una goccia di smalto trasparente ad asciugatura rapida su ciascuno dei quattro angoli del vetrino coprioggetti. Lasciare asciugare per ~ 10 min. Quindi, sigilla i quattro bordi del vetrino coprioggetti con lo smalto per unghie per racchiudere completamente il cervello.
- Immagine immediatamente del cervello o conservare a 4 °C fino al momento dell'immersione.
- Se si esegue l'imaging della fluorescenza intrinseca da fusioni di proteine fluorescenti Htt, eseguire l'imaging del cervello entro 24 ore per ottenere il miglior segnale.
4. Imaging e quantificazione della trasmissione di aggregati simile ai prioni
- Imaging dei cervelli montati utilizzando un microscopio confocale dotato di un obiettivo a olio 40X o 60/63X per raccogliere immagini z-slice attraverso la regione del cervello in cui sono espressi i driver Gal4 e QF selezionati (Figura 2A, B).
- Eccitare le fusioni di proteine fluorescenti o le proteine immunomarcate utilizzando i laser appropriati (ad esempio, 488 nm per GFP/YFP/FITC o 552 nm per mCherry/Cy3). Imposta finestre di rilevamento che catturano un segnale fluorescente massimo eliminando la diafonia dei canali utilizzando un sistema di rilevamento spettrale o filtri di emissione passa-banda/passa-lungo specifici per ciascun fluoroforo.
NOTA: Prestare attenzione durante l'imaging degli aggregati proteici. È facile che i pixel al centro di ogni aggregato si saturino, soprattutto negli aggregati più grandi. Cercare di ridurre al minimo la saturazione dell'immagine, ma prestare attenzione al rischio di perdere il segnale dalle specie aggregate più piccole (Figura 2B, C, D). Troppa saturazione aumenterà lo sfondo dell'immagine, rendendo più difficile l'identificazione dei punti isolati. Testare diverse impostazioni di imaging per ottimizzarle prima di acquisire le immagini finali in ciascun set di dati.
- Analizza i dati quantificando i singoli punti manualmente spostandoti tra le singole z-slice (ad esempio, Figura 2C e Figura 4A) o dopo aver visualizzato le sezioni confocali in 3 dimensioni (Figura 3A, B).
nota: Questo può essere fatto in Image J o in altri software di elaborazione delle immagini.
- Se gli aggregati sono ben separati e la fluorescenza di fondo è minima, utilizzare un software di analisi delle immagini per identificare, quantificare e analizzare sistematicamente gli aggregati come "oggetti" o "superfici" distinti in una ricostruzione 3D della pila confocale (Figura 3B).
nota: Le azioni software descritte sono specifiche per lo strumento e il software utilizzati qui (vedere la Tabella dei materiali).
- Visualizza una serie z confocale in modalità di visualizzazione 3D. Utilizzare la procedura guidata "Analisi" per identificare i singoli punti in un canale selezionato (ad esempio, il canale rosso per gli aggregati HttQ91-mCherry nella Figura 3). Regolare la soglia e i filtri per rappresentare in modo accurato tutti gli aggregati di dimensioni eterogenee come singoli oggetti nell'immagine.
- Abilita "Dividi oggetti" in "Prefiltro elaborazione binaria" per separare gli aggregati strettamente associati che vengono uniti in modo aberrante dall'algoritmo software. Si noti che il numero totale di oggetti e le relative misure sono riportati alla voce "Misure"
nota: Questo metodo per quantificare gli aggregati Htt mutanti non è suscettibile del protocollo di immunocolorazione perché il centro degli aggregati amiloidi è impenetrabile agli anticorpi. Di conseguenza, gli aggregati appaiono al microscopio come strutture ad anello e il software di analisi delle immagini non è in grado di identificare e distinguere con precisione questi singoli "punti".
- Quantificare gli aggregati Htt wild-type spostandosi manualmente nello z-stack e assegnando un punteggio agli aggregati Htt wild-type, assicurandosi che non venga assegnato un punteggio doppio agli aggregati se compaiono in più di una slice (Figura 4A).
nota: Questo approccio di quantificazione manuale può essere utilizzato quando il numero di aggregati in ciascuna pila confocale è ragionevole (ad esempio, 20-50). È anche utile quando il software di analisi delle immagini non è in grado di distinguere i singoli puncta dal segnale circostante nello stesso canale (ad esempio, il segnale proveniente da Htt wild-type diffuso nelle celle vicine) (Figura 2B, C e Figura 4A). Anche la quantificazione degli aggregati Htt wild-type può essere impegnativa perché molte strutture normali del cervello appaiono punteggiate (ad esempio, i processi cellulari e le sinapsi). La co-localizzazione di segnali Htt wild-type e mutanti può essere utilizzata come criterio di selezione; tuttavia, è possibile che alcuni "semi" di Htt mutanti scendano al di sotto del limite di rilevazione del confocale. Una proteina diversa dall'Htt che non si aggrega nelle cellule riceventi (ad esempio, GFP) può essere utilizzata per marcare strutture punteggiate non correlate nel cervello.
- Utilizzare il software di analisi delle immagini per eseguire un'ulteriore caratterizzazione dei singoli aggregati. Ad esempio, è possibile determinare la distribuzione dimensionale degli aggregati (Figura 3C), la percentuale di co-localizzazione tra proteine Htt mutanti e wild-type (Figura 4A) o misurare direttamente le interazioni proteina-proteina utilizzando FRET (Figura 4B).
- Determina la distribuzione dimensionale dei singoli puncta utilizzando un algoritmo di rilevamento di punti o superfici che identifica con precisione tutti gli aggregati visibili in un particolare canale. Utilizzare il software di analisi delle immagini per effettuare misurazioni pertinenti dei punti o delle superfici, ad esempio ottenere informazioni sul "diametro aggregato" (Fig. 3C), sul "volume" o sull'"intensità" da "Misurazioni" nella procedura guidata "Analisi" del software descritta al passaggio 4.2.1.
nota: Nella Figura 3C, riportiamo la distribuzione dei diametri per tutti i puncta HttQ91-mCherry identificati in un singolo glomerulo DA1.
- Determinare la percentuale di co-localizzazione tra gli aggregati HttQ25-YFP e HttQ91-mCherry spostando manualmente fetta per fetta attraverso uno z-stack confocale (il metodo più accurato). Tuttavia, fare attenzione a non contare gli aggregati due volte. Per evitare questo problema, contare gli aggregati in una particolare z-slice solo se il piano di messa a fuoco è passante per il centro dell'aggregato (Figura 4A).
- Calcolare l'efficienza FRET per aggregati HttQ25-YFP indotti con segnale HttQ91-mCherry colocalizzato utilizzando il metodo del fotosbiancamento dell'accettore.
- Innanzitutto, elimina la potenziale diafonia tra i canali YFP e mCherry stabilendo finestre di rilevamento per i segnali solo mCherry e solo YFP che non producono alcun segnale nell'altro canale. Utilizzando queste impostazioni, scattare un'immagine "prima" dei singoli puncta HttQ25-YFP e del segnale HttQ91-mCherry associato (Figura 4B).
- Quindi, fotobleachare il segnale mCherry regolando il laser rosso (ad esempio, 552 nm) al 100% di intensità ed eseguire la scansione fino a quando il segnale non è scomparso. Ripristinare le impostazioni utilizzate per l'immagine "prima" e scattare un'immagine "dopo" dello stesso puncta (Figura 4B).
- Calcola le misure di intensità della fluorescenza per ogni punctum prima e dopo il fotobleaching utilizzando il software di analisi delle immagini.
- Calcola l'efficienza FRET sottraendo la fluorescenza del donatore YFP misurata nell'immagine precedente (YFP iniziale) dalla fluorescenza del donatore YFP nell'immagine posteriore (YFP finale). Dividi questo valore per YFPfinal e moltiplica per 100.
nota: L'efficienza FRET può essere calcolata pixel per pixel o complessivamente per ciascun aggregato HttQ25-YFP (Figura 4B). Il fotobleaching accettore è una tecnica particolarmente utile per calcolare l'efficienza FRET quando il segnale mCherry associato a ciascun punctum HttQ25-YFP è sufficientemente alto da produrre un dequenching YFP rilevabile dopo il photobleaching di mCherry.
