Generazione di una lesione da taglio corticale in un modello murino per indurre l'astrogliosi reattiva

Abstract

Fonte: Allahyari, R. V. et al. Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury. J. Vis. Exp. (2015)

Questo video mostra la procedura di coltellata corticale nei topi, che coinvolge l'esposizione del cranio e la creazione di lesioni cerebrali. Induce l'astrogliosi reattiva, una risposta neuroprotettiva degli astrociti, per studiare i traumi del SNC, l'infiammazione e i meccanismi di riparazione.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparare il mouse per la chirurgia

1. Rimuovere il mouse dalla gabbia di casa e pesare (g).
2. Posizionare il topo in una camera di induzione dell'isoflurano e impostare l'ossigeno a 2 L/min e il vaporizzatore di isoflurano a 5 per indurre un piano chirurgico di anestesia, circa 3-5 minuti. Monitorare la respirazione rallentata e l'immobilizzazione. Verificare che il mouse sia completamente sedato utilizzando il riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.
3. Quando il topo è completamente sedato, posizionarlo in una cornice stereotassica e fissare il naso nel cono del naso, che è attaccato con un tubo all'isoflurano. Inserire le barre auricolari nel condotto uditivo e serrare, assicurandosi che la testa sia stabile.
4. Radere la testa da un orecchio all'altro e da tra gli occhi a dietro le orecchie.
5. Sterilizzare la pelle con salviette alternate di alcool isopropilico e soluzione di iodio betadina, 3 volte ciascuna.
6. Applicare lacrime artificiali su entrambi gli occhi per evitare che si secchino durante la procedura chirurgica.

2. Procedura chirurgica

1. Monitora la profondità dell'anestesia pizzicando la punta o la coda. Il topo si trova sul piano chirurgico appropriato quando non c'è risposta e la respirazione è lenta e uniforme.
2. Praticare un'incisione cutanea parasagittale da dietro gli occhi fino quasi tra le orecchie con un unico movimento deciso utilizzando una lama di bisturi n. 11. Sposta la pelle da parte e aggancia il lato destro con l'emostato.
3. Liberare il cranio dalla membrana sovrastante utilizzando il lato opaco del bisturi n. 11 e gli applicatori con punta di cotone. Facoltativamente, pulire il cranio con un applicatore con punta di cotone imbevuto di soluzione salina allo 0,9%. Lasciare asciugare completamente.
4. Utilizzando un piccolo righello, segnare il bordo anteriore della craniotomia a 1 mm caudale rispetto alla sutura coronale e il bordo sinistro della craniotomia a 1 mm lateralmente alla sutura sagittale (Figura 1) con un pennarello indelebile. Quindi segnare i bordi destro e caudale della craniotomia a 4 mm dalle suture sagittale e coronale, rispettivamente (Figura 1).
5. Usando una punta da trapano da 0,5 mm, inizia a fare una craniotomia perforando lentamente seguendo il contorno del pennarello indelebile. Assicurati di non sfondare completamente il cranio. Premere delicatamente sul pezzo isolato di osso parietale con la pinza n. 5, le aree di debolezza cederanno il passo alla pressione. Quando l'osso assottigliato è sufficientemente debole lungo tutto il perimetro, il pezzo di osso è pronto per la rimozione.
   nota: Se lo sperimentatore ha difficoltà a rimuovere l'osso in un unico pezzo, ciò suggerisce che l'osso non è stato sufficientemente assottigliato durante la perforazione. Prendi in considerazione la possibilità di perforare ulteriormente il cranio negli animali successivi per facilitare la rimozione del pezzo di osso.
6. Utilizzando una siringa da 10 ml dotata di un ago da 23 G, applicare una piccola quantità di soluzione fisiologica allo 0,9% per immergere l'osso isolato e l'area perforata.
7. Fissare il braccio del manipolatore all'apparecchiatura stereotassica. Fissare una nuova lama di bisturi n. 11 al supporto della sonda con il lato affilato della lama rivolto rostralmente.
   nota: Sebbene i tessuti rostrale e caudale subiscano rispettivamente i bordi affilati e smussati della lama, il danno meccanico indotto dalla lesione penetrante è paragonabile per tutta l'estensione della lesione. Non osserviamo differenze apprezzabili nelle principali caratteristiche della gliosi reattiva, inclusa l'upregolazione dell'espressione o della proliferazione di GFAP, tra sezioni rostrali e caudali.
8. Tenendo il braccio del manipolatore fuori mano, sollevare con cautela l'osso isolato utilizzando una pinza angolata 5/45. Inserire la punta della pinza nel lato dell'osso isolato e sollevare, usando la leva per estrarre il pezzo di osso rimasto con un movimento completo><. nota: Fai attenzione a non pugnalare il cervello o disturbare la dura madre sotto il cranio.
9. Prendi un pezzetto di schiuma di gel riassorbibile imbevuta e posizionalo sul cervello scoperto per evitare che si secchi e assorba il sangue che potrebbe essere presente.
10. Una volta che la schiuma di gel è in posizione, far oscillare il braccio del manipolatore in posizione e regolare la lama al centro della craniotomia sopra la schiuma di gel. Rimuovere la schiuma di gel e abbassare la lama fino a quando la punta tocca la dura madre senza forare la dura. Segna le coordinate dorsali/ventrali usando la scala del nonio sul braccio verticale dello stereotassico.
11. Usando il braccio del manipolatore, abbassa lentamente la lama di 3 mm precisi nel cervello. Ciò si ottiene utilizzando i contrassegni della scala del nonio sul braccio del manipolatore. Lasciare che la lama rimanga in posizione per 5-10 secondi. Spostare tre volte il braccio stereotassico con attacco della lama rostrale alla caudale, consentendo alla lama di raggiungere i confini rostrale e caudale della craniotomia prima di spostarsi all'estremità opposta.
    nota: La dura madre non viene rimossa prima di inserire la lama. A differenza della dura di ratto, che ha uno spessore di ~80 μm7, la dura dura di topo è considerevolmente più sottile (solo pochi strati di cellule) e non produce una resistenza apprezzabile alla lama del bisturi durante l'inserimento. Usa una nuova lama di bisturi per ogni topo per assicurarti che ogni animale riceva una ferita costante.
12. Sollevare lentamente il braccio stereotassico, rimuovendo la lama dal cervello. Dopo aver rimosso la lama, posizionare immediatamente un altro pezzo di schiuma gel sulla superficie del cervello per assorbire il sangue o il liquido in eccesso.
13. Nel frattempo, rimuovere il braccio stereotassico e smaltire la lama del bisturi n. 11. Una volta che l'emorragia si è fermata, rimuovere la schiuma di gel.
14. Chiudere la ferita suturando la pelle con punti di sutura non assorbibili, come l'ethilon o il prolene. Le suture devono essere rimosse 9-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
15. Rimetti il mouse nella sua gabbia domestica e lascia che il mouse si riprenda lentamente su un termoforo e monitora eventuali segni di sofferenza. Il recupero dall'anestesia indotta dall'isofluorano avviene in genere entro 2-5 minuti dalla rimozione dall'isofluorano. Non lasciare l'animale incustodito fino a quando non ha riacquistato la decubito sternale.
16. Somministrare 0,5-1 ml di soluzione di Ringer lattato per via sottocutanea per garantire l'idratazione.

Risultati

Figura 1: Schema del cranio del topo raffigurante l'area della craniotomia. Le linee blu rappresentano i segni iniziali che identificano i confini dell'area da perforare. I segni superiore e sinistro sono misurati rispettivamente a 1 mm sotto o lateralmente alle suture coronali o sagittali. I segni inferiore e destro sono misurati rispettivamente a 4 mm dalle suture coronale e sagittale. La craniotom...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stereotassa	Apparato di Harvard	726049
Micro trapano ad alta velocità	Apparato di Harvard	Codice: 724950
lama per bisturi in acciaio inossidabile, #11	MedVet	JOR581S
Pinza angolata 5/45	Strumenti per la scienza	Codice 11251-35
Spugna Gelfoam 12cmx7mm	pescatore	NC9841478
Anticorpi e altri reagenti	fabbricante	Numero di catalogo	Diluizione (campo chiaro) Diluizione (fluorescenza)
Rb anti-GFAP	DAKO	Z033429-2	1:20k 1:1k
Shp anti-BrdU	Abcam	ab1893	1:2k s1:500
Capra biotinilata anti-coniglio	Laboratori Vector	BA-1000	Ore 07:40
Coniglio biotinilato anti-pecora	Laboratori Vector	BA-6000	Ore 07:40
Alexafluor 488 capra anti-coniglio	Tecnologie per la vita	A-11008	Ore 07:40
Alexafluor 568 asino anti-pecora	Tecnologie per la vita	A-21099	Ore 17:40
DAPI Colorazione dell'acido nucleico	Tecnologie per la vita	D3571	Ore 17:40
Cresyl Violet Acetato	Sigma Aldrich	C5042-10G	1%