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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Prelievo di organi e determinazione delle cariche batteriche
- Dopo la perfusione, prelevare gli organi (ad es. fegato, milza) rimuovendo con cura la vascolarizzazione e i legamenti attaccati e posizionando gli organi separatamente in una provetta conica sterile da 15 ml contenente 5 ml di PBS sterile a freddo (4 °C). Conservare i campioni su ghiaccio fino a quando non avviene un'ulteriore elaborazione.
- Per raccogliere il cervello, decapitare la testa dietro le orecchie usando le forbici e tagliare la pelle del cuoio capelluto tra gli occhi dell'animale lungo la linea mediana. Se necessario, tagliare il tessuto in eccesso, tenendo le forbici premute contro il cranio.
- Inserire delicatamente una punta delle forbici nel forame magno (il foro alla base del cranio attraverso il quale passa il midollo spinale) e tagliare lateralmente nel cranio su entrambi i lati.
- Taglia delicatamente il cranio tra gli occhi del roditore lungo la linea mediana, applicando una pressione laterale. Evita di disturbare il cervello e mantieni un contatto minimo tra il tessuto cerebrale e le forbici.
- Usando una pinza a punta fine, apri il cranio per esporre il cervello e posiziona una spatola tra la parte inferiore del cervello e la base del cranio per rimuovere il cervello><.
nota: Ciò provoca la lacerazione delle fibre nervose cerebrali.
- Trasferire con cautela il cervello in una provetta conica da 15 ml contenente 5 ml di PBS freddo sterile.
- Scartare la carcassa del topo e ripetere questi passaggi per gli animali rimanenti.
nota: Una volta che tutti gli organi sono stati prelevati, pulire l'area della procedura e prepararsi per l'omogeneizzazione degli organi per determinare le cariche batteriche.
- Pulire e sterilizzare la punta di un omogeneizzatore di tessuti collocato in una cabina di biosicurezza inserendo la punta e facendo funzionare l'omogeneizzatore per 10 s in sequenza in candeggina al 5%, acqua sterile, etanolo al 75% e acqua sterile, ciascuno contenuto in una provetta conica separata da 15 mL.
- Omogeneizzare il cervello infetto (~20 s con l'impostazione 6, numero di giri massimo) nella provetta conica da 15 mL fino a quando non rimangono frammenti di tessuto visibili.
- Pulire l'omogeneizzatore come descritto al punto 1.3 per evitare la contaminazione batterica da carryover al campione d'organo successivo.
- Eseguire il processo di omogeneizzazione per tutti gli altri organi (ad es. fegato, milza).
- Una volta completato il processo di omogeneizzazione, pulire l'omogeneizzatore come descritto al punto 1.3 e conservarlo fino a nuovo utilizzo.
- Preparare diluizioni seriali di 10 volte degli omogeneizzati d'organo in PBS sterile e preparare le diluizioni su piastre BHI agar/streptomicina per determinare la CFU per organo.
NOTA: Un metodo simile viene eseguito per determinare le CFU per mL di sangue.
- Dopo che tutte le diluizioni sono state piastre, trasferire le piastre in un'incubatrice a 37 °C per una notte.
- Il giorno seguente, contare il numero di colonie su ciascuna piastra per determinare il numero totale di batteri per organo o mL di sangue come segue:
UFC/organo = (numero di colonie x fattore di diluizione) / mL di omogenato placcato x 5
UFC/mL di sangue = (numero di colonie x fattore di diluizione) / mL di sangue placcato