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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Protocollo di immunofluorescenza
- Dissezione tissutale
- Sacrificare il pesce zebra immergendolo in acqua ghiacciata (5 parti di ghiaccio/1 parte di acqua, 4 °C); lasciarlo fino alla cessazione di ogni movimento per garantire la morte per ipossia.
- Rimuovere la testina con una lama di rasoio. Rimuovere i tessuti molli dal lato ventrale del cranio con una pinza. Apri il cranio e rimuovi l'osso dal lato ventrale del cervello. Rimuovere la pelle e le ossa del cranio dal lato dorsale del cervello. Rimuovi il cervello.
- Fissazione tissutale
- Fissare il cervello per immersione per 3 ore in paraformaldeide al 4% (PFA) a 4 °C.
- Preparare il tampone fosfato 0,1 M (PB) sciogliendo 1,755 g di NaH2PO4H2O e 4,575 g di Na2HPO4 in 450 mL di acqua distillata (dH2O) e regolare a un pH di 7,4 con la quantità necessaria di NaOH 1N.
- Preparare il 4% di PFA sciogliendo 4 g di PFA in 100 mL di 0,1 M PB (pH 7,4) agitando su una piastra riscaldante. Al raggiungimento di una temperatura di 60 °C, aggiungere 2-4 gocce di NaOH 1N per ottenere una soluzione limpida. Lasciare PFA al 4% a temperatura ambiente (RT) e controllare il pH. Regolare il pH a 7,4,
nota: Il tempo di fissazione dipende dalle dimensioni del tessuto. La fissazione tissutale per più di 4-6 ore può portare a un'iperfissazione, che maschera gli antigeni e limita il legame anticorpo-epitopo.
- Inclusione tissutale
- Sciacquare i fazzoletti 3 volte per 5 minuti ciascuno, con 0,1 M PB (pH 7,4).
- Per la crioprotezione, trasferire i tessuti al 20% di saccarosio in PB (0,1 M, pH 7,4) e conservare per una notte a 4 °C. Quindi, trasferire i tessuti al 30% di saccarosio in 0,1 M PB (pH 7,4) e conservare per un'altra notte a 4 °C.
- Incorporare i tessuti in un blocco di composto a temperatura di taglio ottimale (OCT). Per fare questo, prepara un piccolo dewar di azoto liquido, prendi un foglio di alluminio e taglialo a metà per creare una padella. La vaschetta contenente i tessuti riempiti con il composto OCT deve essere immersa nell'azoto liquido fino a quando il composto OCT non si è raffreddato. I tessuti congelati possono essere conservati a -80 °C fino al sezionamento.
- Taglio dei tessuti
- Trasferire i blocchi di tessuto congelati in un criostato a -20 °C e tagliarli in sezioni coronali o sagittali di 10 μm.
- Raccogliere i tessuti in sezioni seriali alternate su vetrini adesivi adatti all'immunoistochimica e conservarli a -20 °C fino all'uso.
nota: Conservare i vetrini tra -20 °C e 4 °C in una scatola per diapositive buia o in un album di diapositive.
- Blocco dei siti di legame aspecifici e permeabilizzazione tissutale
- Delimitare l'area del tessuto sul vetrino con una penna resistente ai solventi.
- Sciacquare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna, con 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incubare le sezioni con siero d'asino normale all'1% disciolto nel tampone di permeabilizzazione PB-Triton X-100 0,3% (PB-T) per 30 minuti a RT per permeabilizzare la membrana cellulare e bloccare i siti di legame aspecifici.
- Preparare Triton X-100 0,3% sciogliendo 0,3 mL di Triton X-100 in 100 mL di 0,1 M PB (pH 7,4).
- Preparare la soluzione bloccante sciogliendo l'1% di siero d'asino normale in PB contenente lo 0,3% di TritonX-100.
nota: Le specie animali del siero utilizzato nei tamponi di permeabilizzazione e blocco dipendono dall'ospite dell'anticorpo secondario.
- Incubazione con miscela di anticorpi primari
- Sciacquare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna, con 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incubare le sezioni per una notte in una scatola umida a RT con una miscela di anticorpi primari diluiti in PB-T. Possono essere utilizzate le seguenti miscele di anticorpi primari: anticorpo di capra contro il recettore dell'orexina (OX-2R) diluito 1:100/anticorpo di coniglio contro il recettore dei cannabinoidi (CB1R) diluito 1:100 o anticorpo di capra contro il peptide dell'oressina (OX-A) diluito 1:100/anticorpo di coniglio contro il CB1R diluito 1:100.
- Incubazione con miscela di anticorpi secondari
- Sciacquare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna, con 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incubare le sezioni per 2 ore a RT con 1) un mix di anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor 488 anti-coniglio d'asino e anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor 594 anti-capra d'asino diluito 1:100 in PB-T; o 2) un mix di anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor 488 anti-capra d'asino e anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor 594 anti-coniglio d'asino diluito 1:100 in PB-T.
nota: Utilizzare anticorpi secondari sviluppati nello stesso ospite animale. Il siero normale deve appartenere alla stessa specie di anticorpi secondari (ad esempio, utilizzare anticorpi secondari sviluppati nell'asino e un siero normale nell'asino). Diluire gli anticorpi primari e secondari con un tampone bloccante contenente il detergente per aumentare la permeabilizzazione cellulare e ridurre lo sfondo.
- Montaggio su tessuto
- Sciacquare le sezioni 3 volte per 5 minuti ciascuna, con 0,1 M PB (pH 7,4).
- Controcolorare le sezioni con il colorante nucleare DAPI (4',6-diamidino-2-fenilidolo) preparato sciogliendo 1,5 μL di DAPI (1 mg/mL) in 3 mL di PB.
- Vetrini coprioggetti con mezzo di montaggio (vedi Tabella dei materiali). Questo mezzo di montaggio acquoso stabilizza il campione di tessuto e lo colora per un uso a lungo termine. I campioni fluorescenti possono essere conservati al buio a 4 °C. Per prolungare la durata dei fluorofori, utilizzare un mezzo di montaggio antisbiadimento.
nota: Scegli un buon mezzo di montaggio. Uno dei parametri più importanti degli agenti di montaggio è l'indice di rifrazione (nD), che dovrebbe essere di circa 1,5, l'indice di rifrazione del vetro. Il mezzo di montaggio qui utilizzato può essere utilizzato in particolare con campioni preparati per determinazioni enzimatiche e lipidiche (cioè campioni che non devono essere disidratati con una serie crescente di alcol).
- Controlli
- Ripetere i paragrafi 1.1-1.8, omettendo l'anticorpo primario o secondario, o sostituendo nella fase specifica l'antisiero primario o secondario con PB (controllo negativo).
- Ripetere le sezioni 1.1-1.8, pre-assorbendo ciascun anticorpo primario con un eccesso del peptide relativo (100 mg di peptide/1 mL di antisiero diluito).
- Ripetere le sezioni 1.1-1.8 su fette di cervello di topo (controllo positivo).
nota: Preparate tutti i tamponi freschi, poco prima di iniziare. Rimuovere accuratamente l'eccesso di liquido ad ogni passaggio con una pipetta o carta da filtro attorno alle sezioni, mantenendo sempre la sezione umida.