1. Stabilire il modello BBB
Nota: Per stabilire il modello di barriera emato-encefalica (BBB) suggeriamo di utilizzare cellule endoteliali microvascolari primarie di ratto (RBMEC) e astrociti corticali di ratto (RCA) disponibili in commercio. Tutte le fasi devono essere eseguite con reagenti sterili e prodotti monouso trattati in una cappa a flusso laminare.
- Coltura cellulare
- Rivestire i fiaschi di coltura cellulare con poli-L-lisina 100 μg/ml (1 ora a temperatura ambiente, RT) o fibronectina 50 μg/ml (1 ora a 37 °C) per favorire l'adesione di RCA o RBMEC, rispettivamente. Quindi, scongelare 1 x 106 RCA e 5 x 105 RBMEC in terreno di coltura endoteliale, integrato con il 5% di siero fetale bovino, l'1% di integratore per la crescita delle cellule endoteliali e l'1% di penicillina/streptomicina (sECM). Seme di RCA in un pallone T175 in 20 ml di sECM e RBMEC in un pallone T75 in 10 ml di sECM.
Nota: i passaggi di scongelamento e semina di RCA e RBMEC devono essere regolati in termini di densità cellulare e tempo in coltura in base al numero di condizioni sperimentali da testare con il modello BBB. Iniziando con 1 fiala da 1 x 106 RCA e 1 fiala da 5 x 105 RBMEC, è possibile ottenere fino a 20 inserti BBB-bearing.
- Mantenere le celle a 37 °C e al 5% di CO2 in un'atmosfera umidificata per circa 6 giorni fino a circa l'80% di confluenza per gli RCA e oltre il 90% di confluenza per gli RBMEC. Staccare le cellule utilizzando una soluzione di tripsina-etilendiammina tetraacetica (tripsina-EDTA) (tripsina 1:250) per 5 minuti (1 ml di tripsina per i matracci T75 e 2 ml per i matracci T175). Arrestare l'attività della tripsina con sECM (2:1), centrifugare le sospensioni cellulari a 750 × g per 5 minuti e risospendere i pellet in 60 ml di sECM.
- Dividere gli RBMEC in 3 fiasche T175 e la coltura in sECM per altri 3 giorni prima di seminare sugli inserti. Contare il numero totale di RCA viventi osservando una sospensione cellulare diluita 1:1 con blu di tripano al microscopio ottico in una camera di Burker.
- Semina di celle su inserti
- Trattare un lato della membrana in polietilene tereftalato (PET) di 6 inserti trasparenti multipozzetto con poli-L-lisina 100 μg/mL e l'altro lato con fibronectina 50 μg/mL, per consentire l'attacco di RCA e BMEC. Maneggiare gli inserti con una pinzetta per evitare il contatto con la membrana in PET.
- Posizionare gli inserti in una piastra a 6 pozzetti e aggiungere la soluzione di fibronectina (minimo 500 μl) nella camera superiore. Dopo 1 ora di incubazione a 37 °C, rimuovere la soluzione di fibronectina, rimuovere gli inserti dalla piastra multipozzetto e metterli capovolti sul fondo di una piastra di Petri da 150 cm2, che viene qui utilizzata come supporto sterile per gli inserti già rivestiti.
- Aggiungere delicatamente 800 μl di poli-L-lisina sul lato inferiore dell'inserto (come mostrato nella Figura 1A; indicato come semina RCA) e mantenere la soluzione sugli inserti per 1 ora a RT.
- Aspirare la soluzione e lasciare asciugare gli inserti a RT per 15-30 min. Gli inserti sono ora pronti per la semina cellulare, ma possono anche essere conservati nella piastra multipozzetto per diversi giorni a 4 °C prima di procedere con la costruzione BBB.
Nota: Ricordarsi di mantenere almeno 3 inserti rivestiti liberi dalle celle da utilizzare come controlli per convalidare l'instaurazione della BBB mediante le misure di flusso FD40.
- Seminare RCA (35.000/cm2) sul lato inferiore degli inserti rivestiti di poli-L-lisina facendo cadere 800 μl di sospensione cellulare sull'inserto capovolto (Figura 1A). Lasciare la sospensione RCA sugli inserti per 4 ore a RT per consentire un fissaggio efficiente delle cellule alla membrana.
- Aspirare la soluzione residua, posizionare gli inserti in pozzetti contenenti 2 ml di sECM e mantenere la piastra multipozzetto a 37 °C e 5% di CO2 in atmosfera umidificata, sostituendo il sECM ogni 2 giorni.
- Dopo 3 giorni, quando gli RCA hanno rivestito la faccia inferiore dell'inserto, seminare gli RBMEC sul lato superiore dell'inserto, seguendo questi passaggi:
- Staccare gli RBMEC dai matracci T175 e contare le cellule viventi totali, come riportato nelle fasi 1.1.2 e 1.1.3.
- Seminare RBMEC (60.000/cm2) sulla superficie superiore dell'inserto in sECM (1.000 μl) (Figura 1B), lasciando 3 inserti con solo gli astrociti, da utilizzare come sfondo di resistenza elettrica transendoteliale (TEER). Posizionare la piastra a più pozzetti in condizioni di coltura standard. Mantenere il sistema in coltura per almeno 3 giorni, sostituendo la sECM nella camera interna e inferiore ogni 2 giorni.
2. Convalida BBB
- Misurazione TEER
- Il 3° giorno di co-coltura, controllare il TEER inserendo gli inserti contenenti BBB in una camera appropriata (con tappo e dove sia la camera che il cappuccio contengono una coppia di elettrodi di rilevamento della tensione e di corrente), riempita con 4 ml di sECM. Collegare a un volt/ohmmetro del tessuto epiteliale.
- Insieme alle misure TEER dei sistemi BBB a celle, registrare i valori TEER dei 3 inserti recanti gli RCA che verranno sottratti dai valori ottenuti con i BBB. Moltiplicare i valori TEER risultanti per la superficie dell'inserto (4,2 cm2) in modo da esprimere i risultati come Ω xcm 2.
- A partire dal 3° giorno di co-cultura, misurare il TEER ogni giorno. nota: Dopo un periodo iniziale in cui il TEER aumenta, i valori registrati dovrebbero rimanere stabili per almeno due giorni consecutivi (di solito tra il 5° e il 7° giorno di co-coltura). A quel punto, la BBB è pronta per la seconda fase di validazione (sezione 2.2) e/o per gli esperimenti trans-BBB.
Nota: La procedura descritta nella sezione 2.1 può essere eseguita sugli stessi sistemi BBB dedicati ai seguenti esperimenti di permeabilità (sezione 3). Operare in condizioni sterili.
3. Permeazione trans-BBB di ferritine caricate con FITC (FnN)
Nota: Una variante ricombinante della ferritina umana (Fn), prodotta in Escherichia coli e assemblata in nanogabbie (FnN). Gli FnN sono caricati con isotiocianato di fluoresceina (FITC) e le concentrazioni sia di Fn che delle molecole caricate sono determinate con precisione.
- Flusso trans-BBB di FITC e FITC-FnN
- Misurare il flusso di FITC-FnN dalla camera superiore a quella inferiore dei modelli BBB convalidati (di solito al 5° - 7° giorno di co-coltura), rispetto a quello del colorante libero dopo 7 e 24 ore di incubazione, secondo i seguenti passaggi:
- Aggiungere FITC-FnN (50 μg/ml FnN, 1,1 μM FITC) o una quantità uguale di FITC libero nella camera superiore di almeno 6 sistemi BBB per ciascuna formulazione, al fine di prelevare 2 ml di soluzione sECM dalla camera inferiore di almeno 3 inserti dopo 7 ore e dalla camera inferiore di altri 3 inserti dopo 24 ore.
- Misurare l'intensità di fluorescenza di 500 μl dei campioni raccolti mediante spettrofluorimetro (λex 488 nm, λem 515 nm, fessura 5).
- Ottenere la fluorescenza di fondo sECM misurando 500 μl di terreno utilizzando gli stessi parametri analitici. Sottrarre la fluorescenza di fondo sECM da tutti i valori di fluorescenza FITC o FITC-FnN.
- Determinare la concentrazione di FITC o FITC-FnN permeato confrontando i valori di fluorescenza ottenuti con due diverse curve di calibrazione prodotte con concentrazioni note (es. 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) del colorante libero o nanoformulato disciolto in 500 μl di sECM.
