Misurazione dell'attività del proteasoma in diversi compartimenti subcellulari del cervello di ratto

1. Saggio dell'attività del proteasoma

NOTA: L'attività del proteasoma può essere misurata nel tessuto cerebrale omogeneizzato utilizzando una versione leggermente modificata del 20S Proteasome Activity Kit. Questo test non misura direttamente l'attività di complessi completi di proteasoma 26S. Piuttosto, misura l'attività del nucleo 20S, il che significa che può servire solo come proxy per comprendere l'attività del nucleo stesso rispetto all'intero complesso del proteasoma 26S. Il successo di questo test diminuisce con ripetuti cicli di congelamento-scongelamento e/o livelli crescenti di detergenti, in particolare ionici, e richiede l'uso di un lettore di piastre con un set di filtri 360/460 (eccitazione/emissione) e capacità di riscaldamento fino a 37 °C.

1. Impostazioni del lettore di piastre: Preriscaldare a 37 °C e mantenere per tutta la durata del ciclo.​
   1. Impostare l'eccitazione su 360 e l'emissione su 460. Se la piastra a 96 pozzetti utilizzata è chiara, impostare la posizione dell'ottica su Bottom. Se si utilizza una piastra a 96 pozzetti scura/nera, impostare la posizione dell'ottica su Superiore.
   2. Impostate i vecchi modelli di lettori di lastre su Auto-Gain sotto le opzioni di lettura fluorescente; i modelli più recenti sono preimpostati per questo. Programmare una corsa cinetica con un tempo di 2 ore, scansione (lettura) ogni 30 minuti.
2. Ricostituire il tampone per test 10x fornito nel kit con 13,5 mL di acqua ultrapura. Aggiungere 14 μl di ATP 100 mM al tampone ora 1x; Ciò migliora significativamente l'attività del proteasoma nei campioni e migliora l'affidabilità del test. Il tampone finale del saggio 20S può essere conservato su ghiaccio o a 4 °C fino al momento del bisogno ed è stabile per diversi mesi.
3. Ricostituire lo standard AMC fornito nel kit con 100 μL di DMSO. Eseguire questo passaggio al buio o in condizioni di scarsa illuminazione, poiché lo standard è sensibile alla luce.
4. Create una curva standard di AMC utilizzando lo standard ricostituito, al buio o in condizioni di scarsa illuminazione.
   1. In provette per microcentrifuga separate da 0,5 mL, aggiungere 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 e 0 μL dello standard AMC, che corrisponde a una concentrazione di AMC di 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 e 0 μM.
   2. A queste provette, nello stesso ordine, aggiungere 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 e 100 μl di tampone di saggio 20S. In questo modo si crea una serie di concentrazioni di AMC da alte a basse, che verranno utilizzate per la calibrazione del lettore di piastre e l'analisi dell'attività del proteasoma nei campioni omogeneizzati.
   3. Conservare tutti gli standard diluiti su ghiaccio al buio fino al momento del bisogno.
5. Ricostituire il substrato del proteasoma (Suc-LLVY-AMC) fornito in kit con 65 μL di DMSO. Eseguire questo passaggio al buio o in condizioni di scarsa illuminazione, poiché il substrato è sensibile alla luce. Creare una diluizione 1:20 del substrato del proteasoma in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando il tampone del saggio 20S. Conservare il substrato diluito su ghiaccio al buio fino al momento del bisogno.
   nota: Ad esempio, se la piastra avrà 10 campioni e 1 bianco, sarà necessario una quantità sufficiente di substrato diluito per 22 pozzetti (con duplicati) a 10 μl per pozzetto. Ciò equivale a 220 μl necessari + 30 μl per gli errori di pipettaggio, che richiedono 12,5 μl di substrato e 237,5 μl di tampone per saggio 20S.
6. Scongelare i campioni desiderati (se congelati) e aggiungere una quantità normalizzata a una piastra a 96 pozzetti. Eseguire ogni campione in duplicati. La quantità di campione necessaria varia in base alla preparazione del tessuto. Generalmente, 10-20 μg sono sufficienti per qualsiasi frazione subcellulare.
7. Portare il volume del pozzetto del campione a 80 μl con acqua ultrapura. La quantità aggiunta dipende dal volume di campione aggiunto. Ad esempio, se il campione 1 era di 4,5 μL di proteine e il campione 2 era di 8,7 μL, la quantità di acqua necessaria sarà rispettivamente di 75,5 μL e 71,3 μL. In due pozzetti separati, aggiungere 80 μL di sola acqua; questi saranno i Sasay Blanks.
   nota: Al fine di limitare le variazioni di volume delle proteine dovute a errori di pipettaggio, le concentrazioni proteiche possono essere normalizzate al campione meno concentrato. Ciò consentirà l'uso dello stesso volume di campione in tutte le condizioni.
8. Aggiungere 10 μl di tampone per saggi 20S a ciascun pozzetto, compresi i bianchi per saggi. In questo caso si consiglia di utilizzare un ripetitore/pipetta automatica per garantire un volume di analisi costante tra i pozzetti.
9. Facoltativo: in questa fase, se lo si desidera, introdurre manipolazioni in vitro; ciò richiederà che ogni campione abbia 2 pozzetti aggiuntivi per trattamento, compreso il veicolo. In tal caso, aggiungere 5-10 μL di farmaco/composto di interesse a 2 dei pozzetti del campione e un volume equivalente di controllo/veicolo ad altri 2 pozzetti. Posizionare la piastra sul lettore di piastre preriscaldato o in un incubatore a 37 °C per 30 minuti.
10. Spegni le luci o entra in una stanza buia. Aggiungere tutti i 100 μl di standard AMC diluiti in un nuovo pozzetto; Ogni standard avrà un singolo pozzo.
11. Al buio, aggiungere 10 μl di substrato di proteasoma diluito ai pozzetti contenenti campioni e saggi bianchi, ma non allo standard AMC. In questo caso si consiglia di utilizzare un ripetitore/pipetta automatica per garantire un volume di analisi costante tra i pozzetti.
12. Posizionare la piastra nel lettore di piastre e avviare la corsa cinetica.
    nota: La piastra non deve essere sottoposta a costante agitazione durante la corsa cinetica, tuttavia, l'utente può scegliere di farlo se lo desidera
13. Al termine dell'esecuzione cinetica, esportare i valori di fluorescenza 360/460 grezzi in Microsoft Excel.
    1. Calcolare la media dei pozzetti duplicati per ogni standard, ogni campione e il bianco del saggio per tutte e 5 le scansioni. I valori di fluorescenza grezza dovrebbero aumentare tra le scansioni per i campioni, ma rimanere stabili (o diminuire leggermente) per gli standard e i bianchi di saggio.
    2. Prendere la media dei pozzetti standard AMC più alta e dividerla per la concentrazione nota (20 μM). Dividere questo valore per la concentrazione del campione utilizzata nel test per ottenere un valore AMC standardizzato. Per ogni campione e media del bianco del saggio, dividere per il valore AMC standardizzato.
    3. Prendere questo valore finale e dividerlo per la concentrazione del campione utilizzata nel test per ottenere il valore normalizzato per ciascun campione e il bianco del saggio. Fallo per tutte e 5 le scansioni.
    4. Sottrarre il valore normalizzato del bianco del saggio da ciascun valore del campione normalizzato per tutte e 5 le scansioni.