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Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dall'appropriata revisione etica degli animali.
1. Preparazione dei reagenti
- Tampone per la digestione (1 ml per emisfero): sciogliere una miscela standardizzata di enzimi digestivi purificati, ad es. Liberase con una bassa concentrazione di termolisina (TL) a una concentrazione di 2U/ml in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) contenente calcio (Ca) e magnesio (Mg).
- Tampone di lavaggio con DNAsi: Sciogliere la DNAsi I ad una concentrazione di 666U/ml in HBSS (Ca/Mg (calcio/magnesio) libero) contenente il 10% di siero fetale di vitello (FCS).
- Tampone di lavaggio senza DNAsi: HBSS (Ca/Mg free) contenente il 10% di FCS.
- Terreno a gradiente di densità (5 ml per emisfero): preparare il mezzo a gradiente di densità isotonico (SIP; 100%) mescolando nove parti di terreno a gradiente di densità con una parte di cloruro di sodio 1,5 M. Diluire il SIP al 25% di densità aggiungendo un volume appropriato di HBSS (privo di Ca/Mg) contenente il 3% di FCS.
2. Dissociazione del tessuto cerebrale in sospensioni a singola cellula
- Rimuovere con cura il tronco encefalico e il cervelletto con una lama di rasoio pulita. Usa una lama di rasoio pulita per emisectare il cervello e taglia ogni emisfero lungo il piano coronale in tre pezzi di dimensioni più o meno uguali.
- Il trito ha sezionato il tessuto di ciascun emisfero attraverso un colino cellulare da 100 μm utilizzando l'estremità dello stantuffo di una siringa da 5 ml. Sciacquare continuamente il filtro cellulare con HBSS ghiacciato (+Ca/Mg). Conservare i campioni omogeneizzati su ghiaccio.
- Centrifugare a 286 x g e 4°C per 5 min, scartare con cura il surnatante. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone di digestione e trasferire la sospensione in un tubo da 2 ml. Incubare la sospensione in lenta rotazione continua a 37 °C per 1 ora.
- Setacciare la sospensione cellulare con un colino cellulare da 70 μm e risciacquare abbondantemente con 3 ml di tampone di lavaggio contenente DNAsi, seguiti da 15 ml di tampone di lavaggio privo di DNAsi. Centrifugare a 286 x g e 18 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante. nota: L'uso della DNAsi elimina il muco del DNA causato dalla lisi cellulare, che potrebbe portare all'aggregazione cellulare, compromettendo la sopravvivenza cellulare.
3. Centrifugazione in gradiente di densità per la rimozione di mielina e detriti cellulari
- Risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno con gradiente di densità del 25% e pipettare la sospensione in una provetta da 15 ml. Miscelare accuratamente mediante pipettaggio ripetuto e delicato, evitando la formazione di bolle. nota: Il mezzo di gradiente di densità deve essere utilizzato a RT per prevenire l'aggregazione delle cellule.
- Centrifugare a 521 x g e 18 °C per 20 min. Utilizzare il profilo di accelerazione più basso del rotore e lasciare che il rotore si fermi senza freni. Rimuovere delicatamente le provette dalla centrifuga senza agitarle. Aspirare con cura il rivestimento mielinico e il surnatante preservando il pellet cellulare sul fondo della provetta. nota: Assicurati di rimuovere l'intero rivestimento mielinico, poiché eventuali residui comprometteranno l'analisi citofluorimetrica.
- Risospendere il pellet in 10 ml di tampone di lavaggio privo di DNAsi e pipettare la sospensione in una nuova provetta da 15 ml. nota: Questa fase di lavaggio è fondamentale poiché una rimozione sufficiente del mezzo del gradiente di densità contribuisce in modo significativo alla quantità e alla qualità del campione di cellule finale.
- Centrifugare nuovamente a 286 x g e 10 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 100 μl di tampone di lavaggio a freddo e determinare la conta cellulare e la vitalità mediante esclusione del blu di tripano in un emocitometro. Conservare i campioni a 4 °C e processarli rapidamente.