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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione degli animali
- Indurre l'anestesia iniettando ketamina (70 mg/kg) e xilazina (16 mg/kg) per via intraperitoneale. Mantenere la normale temperatura corporea, contribuendo alla rapida induzione dell'anestesia profonda. Verifica un'adeguata sedazione con uno stimolo doloroso, come un pizzico di dito del piede, e verifica l'assenza di una reazione.
- Radere accuratamente i peli del collo del topo con un rasoio, pulirli con etanolo al 70% seguito da betadina/clorexidina e applicare lidocaina all'1% sulla superficie della pelle per il controllo locale del dolore.
- Posiziona il mouse in posizione supina. Usa il nastro adesivo per fissare gli arti e la coda, allungando delicatamente la pelle del collo sul lato opposto dell'intervento. Contemporaneamente, sollevare leggermente il collo.
- Utilizzare un unguento oftalmico (ad es. 5% di dexpantenolo) per prevenire la disidratazione degli occhi durante l'operazione.
2. Induzione SAH
- Aprire la pelle del collo con un bisturi sterile, dal mento al bordo superiore dello sterno (1,5 cm), e separare bruscamente le ghiandole salivari dal tessuto connettivo circostante.
- Separare il gruppo muscolare lungo un lato [in questo caso, il lato destro] della trachea, esponendo la guaina dell'arteria carotide comune (CCA) ricoperta di vasi sanguigni e venule nutrienti. Il CCA e i nervi si trovano in stretta vicinanza l'uno all'altro.
- Dissociare il CCA e lasciare un libero 8-0 sutura di seta attorno al CCA senza legarlo in anticipo. Prestare attenzione alla protezione del nervo vagale, poiché si danneggia facilmente (Figura 1A).
- Una triplice biforcazione del CCA, dell'arteria carotide interna (ICA) e dell'arteria carotide esterna (ECA) è visibile lungo il terzo posteriore inferiore della diastasi. Sezionare l'estremità distale dell'ECA e legare il vaso due volte il più lontano possibile in modo distacco.
- Scollegare l'ECA nel punto medio del segmento legato due volte, creando un moncone del vaso.
- Predisporre una legatura per il filamento attorno al moncone ECA, non chiuderla fino a quando il filamento non è stato inserito correttamente.
- Utilizzare una sutura o una micro clip per occludere temporaneamente l'ICA e il CCA (Figura 1B).
- Praticare una piccola incisione (circa la metà del diametro dell'ECA) nell'ECA utilizzando le forbici microvascolari. Inserire un filamento di prolene 5-0 (in alternativa 4-0) nell'ECA e farlo avanzare nel CCA.
- Chiudere leggermente la legatura sull'ECA allentando la micro clip sull'ICA e sul CCA (Figura 1C).
- Tirare delicatamente indietro il filamento e regolare il moncone ECA in direzione cranica, invaginando il filamento attraverso la biforcazione nell'ICA (Figura 1D).
- Puntare la punta del filamento medialmente con un angolo di ~30° rispetto alla linea mediana tracheale e ~30° rispetto al piano orizzontale. Spingere il filamento in avanti all'interno dell'ICA. Dopo aver raggiunto la biforcazione tra arteria cerebrale anteriore (ACA) e arteria cerebrale media (MCA), si incontra resistenza (~9 mm).
- Far avanzare ulteriormente il filamento di 3 mm, perforando l'ACA destro. Ritirare prontamente il filamento nel moncone ECA, consentendo il flusso sanguigno nello spazio subaracnoideo.
- Mantenere il filamento in questa posizione per circa 10 s (Figura 1E). La presenza di tremori muscolari, miosi omolaterale, respiro affannoso, ritmo cardiaco alterato e incontinenza urinaria possono essere prove di successo dell'intervento chirurgico.
- Chiudere temporaneamente il CCA per evitare un'eccessiva perdita di sangue. Estrarre istantaneamente il filamento e legare l'ECA con la sutura predisposta. Riaprire il CCA e consentire la riperfusione e l'ulteriore versamento di sangue nello spazio subaracnoideo (Figura 1F).
- Dopo aver verificato la presenza di perdite di sanguinamento, disinfettare la pelle che circonda la ferita per prevenire infezioni cutanee postoperatorie e suturare la ferita con una sutura in fibra di poliestere 4-0 non assorbibile.
- Metti il mouse in una scatola termica fino a quando non riprende conoscenza. Attendere che l'animale sia completamente sveglio e assicurarsi che abbia riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Non restituire gli animali in compagnia di altri topi fino a quando non si sono completamente ripresi.
- Somministrare 200-300 mg/kg di paracetamolo di peso corporeo per alleviare il dolore postoperatorio.
- Controlla i topi ogni giorno dopo l'intervento chirurgico.
