Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei reagenti e delle forniture
- Determinare la dose di L-3,4-diidrossifenilalanina estere metilico cloridrato (levodopa o L-DOPA) e benserazide cloridrato, un inibitore periferico della decarbossilasi (vedere la Tabella dei materiali), la frequenza di valutazione e la sequenza temporale sperimentale appropriate per la domanda sperimentale (Figura 1).
nota: Le domande sperimentali possono essere poste per cercare un numero qualsiasi di risposte, che vanno dalla domanda se una terapia specifica possa ridurre le discinesie indotte da L-DOPA (LID) esistenti alla prevenzione dell'induzione di LID. Possono anche esplorare se l'efficacia terapeutica dipende dalla dose di levodopa o se l'espressione di LID e/o l'efficacia terapeutica variano a seconda del sesso, della specie e dell'età del soggetto.
- Pesare i ratti settimanalmente per calcolare la quantità di farmaco appropriata in base alle variazioni di peso in corso durante lo studio.
nota: A causa dell'aumento dell'attività nei ratti LID+, esiste un potenziale di perdita di peso con trattamenti a lungo termine con L-DOPA. Se si verifica una perdita di peso, fornire ai ratti bocconcini nutrizionalmente completi e altamente appetibili (vedere Tabella dei materiali) dopo le iniezioni di L-DOPA.
- Calcolare la quantità di L-DOPA e benserazide necessaria per ciascuna concentrazione settimanale, pesando le aliquote liofilizzate per ogni giorno di iniezione e conservando in combinazione per 1-2 settimane a -20 °C in flaconcini di vetro ambrato fino al giorno del trattamento.
nota: La dose target è di 12 mg/kg o 12 mg di L-DOPA/1000 g di peso corporeo. Le informazioni supplementari forniscono un esempio di calcoli per determinare la quantità di L-DOPA e soluzione salina necessaria per ogni giorno della settimana utilizzando 12 mg di L-DOPA/kg di peso corporeo a un volume di iniezione di 1 cc/kg di peso nel ratto.
2. Allestimento della stanza e della gabbia
- Il primo giorno di trattamento con L-DOPA 3-4 settimane dopo l'intervento chirurgico per la lesione da 6-idrossidopamina (6-OHDA), trasferire i ratti in un unico alloggiamento, compreso l'arricchimento approvato da IACUC.
- Mantenere in un unico alloggio durante lo studio per evitare interferenze tra pari con le valutazioni comportamentali.
- Nei giorni di valutazione LID, posizionare le gabbie domestiche su una griglia di filo d'acciaio, ruotata di circa 45° per una visione ottimale del ratto (Figura 2A). Capovolgere le targhette di identificazione (Figura 2B) verso l'alto e rimuovere le bottiglie d'acqua, gli scaffali per alimenti e tutti i tipi di arricchimento nella gabbia (Figura 2C) per evitare interferenze con le valutazioni comportamentali.
3. Iniezioni di levodopa e valutazione della discinesia
- Iniezioni sottocutanee di L-DOPA
- Immediatamente prima dell'iniezione giornaliera di L-DOPA, aggiungere il volume appropriato di soluzione fisiologica sterile alla miscela di L-DOPA liofilizzato pre-pesato e benserazide nel flaconcino di ambra e agitare bene per 10 s (passaggio 1.3).
NOTA: Il volume target di iniezione è di 1 mL/1000 g di peso corporeo (con 12 mg di L-DOPA per mL). Il volume della soluzione salina sterile dipenderà dal numero di animali per studio.
- Riempire le singole siringhe (ad es. 1,0 o 0,5 ml con ago da 26 G) con il volume richiesto per ciascun animale (1 ml/kg di peso del ratto) ed etichettare ogni siringa con l'identificazione individuale dell'animale.
nota: Tenere le siringhe riempite al riparo dalla luce in buste sterili fino al momento dell'iniezione. La L-DOPA si ossida rapidamente in presenza di ossigeno e luce in un ambiente acquoso.
- Portare la prima gabbia al banco di iniezione.
- Rimuovi il ratto dalla sua gabbia e posizionalo sulla superficie di iniezione.
- Trattenere delicatamente la testa e le spalle contro la superficie su cui il ratto è appoggiato con il palmo della mano non dominante.
- Strofinare delicatamente la pelle sul dorso sovrastante le scapole con il pollice e l'indice della mano non dominante. Quindi, iniettare il volume di L-DOPA con la mano dominante nello spazio sottocutaneo tra/sotto le dita, mantenendo l'ago il più parallelo possibile al corpo per evitare l'iniezione intramuscolare><.
nota: I ratti non vengono anestetizzati prima dell'iniezione.
- Smaltire ogni singola siringa usata in un contenitore affilato.
- Sostituisci il ratto nella sua gabbia individuale e aggiungi bocconcini nutrizionalmente completi tranne nei giorni di valutazione LID per evitare interferenze con le valutazioni comportamentali fino a quando le valutazioni non sono complete.
- Impostare il timer per 1-2 minuti a seconda del tempo di valutazione desiderato e del numero di ratti nello studio nei giorni di valutazione. Recupera la gabbia successiva e inietta il topo successivo quando il timer lo indica.
- Ripeti l'operazione, iniettando un ratto ogni 1-2 minuti, fino a quando tutti i ratti sono stati iniettati.
- Valutazione della discinesia indotta da levodopa dopo l'iniezione
- Valutare l'intensità (Tabella 1) e la frequenza (Tabella 2) dei movimenti distonici e ipercinetici della discinesia al numero di punti temporali desiderato, che dovrebbero includere l'inizio iniziale del comportamento LID, il picco di comportamento e la fase di declino.
- Per i ratti adulti maschi e femmine Sprague Dawley o Fisher 344 e una dimensione del campione di N = 40 ratti, iniziare le valutazioni della discinesia 20 minuti dopo la prima iniezione di L-DOPA, e poi a intervalli di 50 minuti fino a 220 o 270 minuti dopo l'iniezione, a seconda di quando i comportamenti LID sono interrotti nel 90%-100% dei ratti.
- Se si utilizzano intervalli di valutazione di 1 minuto, impostare un timer per 1 minuto. Valutare il primo ratto per un minuto. Passa al topo successivo e valutalo per 1 minuto. Continua attraverso tutti i ratti, valutando per intervalli di 1 minuto.
- Posizionare un timer accanto alla gabbia in modo visibile in modo che l'intensità del comportamento LID (Tabella 1) possa essere osservata mentre si stima la frequenza di un determinato comportamento (Tabella 2) durante il periodo di valutazione.
- Dopo aver completato le valutazioni per il primo punto temporale, ricominciare con il primo ratto al punto temporale successivo (ad es. 70 minuti dopo l'iniezione) e continuare all'intervallo desiderato (ad es. ogni 50 minuti) fino a quando tutti i punti temporali sono stati completati.
nota: A causa della sovrapposizione delle attività di iniezione di L-DOPA e di valutazione LID, sono necessarie due persone nei giorni di valutazione, una per l'iniezione e una per le valutazioni comportamentali.
