Rilevamento dell'invecchiamento neuronale in una sezione di organoide corticale

Abstract

Fonte: Shaker, M. R., et al. Generazione robusta e altamente riproducibile di organoidi cerebrali corticali per la modellazione della senescenza neuronale cerebrale in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video mostra il metodo per rilevare i neuroni che invecchiano nelle sezioni corticali degli organoidi mediante colorazione per l'attività della beta-galattosidasi, che è elevata nelle cellule senescenti. L'enzima scinde un substrato per produrre un prodotto blu, seguito dall'osservazione microscopica dei neuroni colorati.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Caratterizzazione dell'invecchiamento neuronale negli organoidi corticali

1. Processo di organoidi corticali per criosezioni:
   nota: I passaggi sono stati eseguiti in una cappa di biosicurezza di Classe 2.
   1. Preparare provette da 2 mL, ciascuna riempita con 1,5 mL di paraformaldeide al 4% (PFA).
   2. Tagliare l'estremità di un puntale per pipetta P1000 (per renderlo a foro largo) e trasferire delicatamente ciascun organoide in una delle provette da 2 mL preparate sopra (un organoide per provetta).
      nota: Per evitare un'eccessiva miscelazione dei terreni di differenziazione (DM) con il PFA, lasciare che l'organoide affondi verso l'apertura del puntale della pipetta P1000 e appoggiare il puntale appena sopra la parte superiore del PFA nella provetta prima di pipettare l'organoide. Ciò consentirà al ricercatore di trasferire solo l'organoide e un terreno minimo.
   3. Lasciare che il processo di fissaggio avvenga a 4°C per 1 ora.
   4. Utilizzando un puntale per pipetta P1000 non tagliato, aspirare con cura il PFA in eccesso e aggiungere 1,5 ml di PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) freddo.
   5. Trasferire le provette in un agitatore orbitale impostato a 70 giri/min per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
   6. Ripetere il processo di lavaggio con 1 PBS a freddo tre volte per assicurarsi che tutto il PFA sia stato completamente rimosso.
      nota: Non smaltire il PFA nei normali contenitori per rifiuti; invece, prepara un contenitore specifico per lo smaltimento dei rifiuti chimici per questo, poiché il PFA è un pericolo.
   7. Immergere gli organoidi in 1x PBS contenente il 30% di saccarosio e incubare a 4 °C fino a quando tutti gli organoidi non sono affondati sul fondo della provetta.
      nota: Il tempo necessario agli organoidi per affondare dipende dalle loro dimensioni e dalla loro età. Gli organoidi di tre mesi possono richiedere fino a 5 ore.
   8. Utilizzando un puntale per pipetta P1000 tagliato e a foro largo, trasferire delicatamente da tre a cinque organoidi in uno stampo di montaggio contenente una soluzione di montaggio composta al 30% da saccarosio e 100% di mezzo a temperatura di taglio ottimale (OCT) con un rapporto di 3:2.
   9. Utilizzare un puntale per pipetta da 10 μl con l'aiuto di uno stereomicroscopio per orientare e posizionare gli organoidi in uno schema a griglia.
   10. Posizionare lo stampo su ghiaccio secco per solidificare la soluzione OCT di saccarosio prima di procedere con la criosezione (16-20 μm) utilizzando un criostato.
       nota: Per la beta-galattosidasi associata alla senescenza, tutti i tessuti devono essere processati per il sezionamento una volta che sono affondati. Per l'immunofluorescenza, i tessuti possono essere processati per il sezionamento il giorno successivo. Se non colorati immediatamente, tutti i vetrini contenenti sezioni devono essere conservati a -20 °C prima della successiva immunofluorescenza o beta-galattosidasi.
2. Processo per l'analisi della senescenza negli organoidi cerebrali corticali:
   nota: I seguenti passaggi possono essere eseguiti su un normale banco da laboratorio.
   1. Trasferire i vetrini in un contenitore per la colorazione dei vetrini da microscopio con coperchio e lavare il tessuto organoide sezionato tre volte con 1x PBS per 10 minuti a RT per rimuovere la soluzione di montaggio in eccesso.
   2. Successivamente, incubare il tessuto lavato con una soluzione colorante di beta-galattosidasi appena preparata per una notte a 37 °C.
      nota: La soluzione di colorazione beta-galattosidasi è costituita da tampone fosfato (per 10 mL di tampone fosfato: 8,15 mL di 1 M NaH₂PO₄, 1,85 mL di 1M Na₂HPO₄) pH aggiustato = 6, 100 mM di esacianoferrato di potassio (III), 100 mM di esacianoferrato di potassio (II) triidrato, 5 M di NaCl, 1 M di MgCl₂, 20 mg/mL di X-Gal. Evitare l'uso di un incubatore per colture cellulari standard contenente CO₂ poiché la CO₂ altera il pH della soluzione di colorazione della beta-galattosidasi.
   3. Per rimuovere la soluzione di beta-galattosidasi, lavare i tessuti colorati con 1x PBS tre volte per 10 minuti ciascuno a RT.
   4. Montare i fazzoletti lavati con un montante antisbiadimento in vetro e lasciare solidificare la soluzione di montaggio per 30 minuti a RT prima di visualizzarli al microscopio.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
16% Formaldeide (P/V) Senza metanolo	Thermo Fisher Scientific	28908	Il 4% dei PFA viene diluito in 1x PBS
Microscopio CKX53 con fotocamera SC50	Olimpo
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Sigma Aldrich Pty Ltd	D1408-500ML
Terreno neurobasale	Thermo Fisher Scientific	21103049	Utilizzato nei media DM
OCT Composto per l'inclusione Sakura Clear (118 mL/bottiglia)	Tessuto Tek	4583
Esacianoferrato di potassio (II) triidrato	Sigma Aldrich Pty Ltd	CP1087
Esacianoferrato di potassio(III)	Sigma Aldrich Pty Ltd	455946
Prolong Glass Antifade Mountant	Tecnologie per la vita in Australia (TFS)	P36980
Saccarosio	Sigma Aldrich Pty Ltd	PHR1001-1G	Il 30% del saccarosio viene diluito in 1x PBS