Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Inoculazione del virus
- Sterilizzazione della siringa per iniezione
- Rimuovere il tappo della siringa da insulina. Aggiungere un tubo di polietilene come collare attorno all'ago per garantire un'adeguata profondità di iniezione di 2,5 mm. Immergere la siringa in etanolo per 30 minuti. Mettere la siringa sotto la luce UV per 30 minuti.
- Rimettere il cappuccio sull'ago. Avvolgere la siringa in una busta sterilizzante e chiuderla con nastro adesivo. Etichettare con la data di preparazione.
- Iniezione di virus
- Prendi aliquote del ceppo di TMEV di Daniel dal congelatore a -80 °C. Scongela il virus e tienilo in ghiaccio. Evitare di scongelare e ricongelare il virus. Caricare la siringa con la sospensione virale (3 x 105 unità formante placca [PFU] diluita in 20 μL di soluzione salina tamponata con fosfato [PBS] o terreno di coltura Eagle medium modificato [DMEM] di Dulbecco).
ATTENZIONE: Il virus è contagioso per i topi ma non per gli esseri umani.
- Pulire il banco con un disinfettante e lavorare sotto un assorbitore di fumi. L'inoculazione del virus non è sterile ma è il più pulita possibile.
- Trasferire il topo nella camera di induzione dell'anestesia e utilizzare il 2% di isoflurano nell'ossigeno per indurre l'anestesia. Il raggiungimento della tolleranza chirurgica richiede pochi minuti; Regolare la concentrazione in base alla respirazione dell'animale e alla profondità dell'anestesia.
- Trasferire il mouse anestetizzato dalla scatola per anestesia sotto il cofano. Controllare la tolleranza chirurgica, ad es. pizzicando le dita dei piedi. L'intera procedura viene eseguita in meno di 30 s, quindi l'animale non ha bisogno di inalare isoflurano durante l'iniezione. Aggiungi un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza della cornea.
- Pulisci la testa dell'animale con un tampone imbevuto di alcol. Inclinare leggermente la testa del mouse verso sinistra in modo che il sito di iniezione sia rivolto verso l'alto.
- Tirare leggermente la pelle all'indietro, inserire l'ago nella testa e iniettare 20 μl per via intracorticale a una profondità di 2,5 mm nella regione temporale dell'emisfero destro (posteriore e mediale all'occhio destro).
- Eseguire l'iniezione unilateralmente nello stesso emisfero in tutti gli animali. Usa l'occhio e l'orecchio come punti di riferimento per la posizione della corteccia parietale. Il posizionamento è stato precedentemente verificato istologicamente; vedi Figura 1. Le coordinate di iniezione secondo l'iniezione stereotassica in relazione al bregma sono −2.0 (AP); +3,0 (ML); -1,5 (DV).
- Lasciare la siringa in posizione per 5-15 s. Annotare se ci sono perdite dall'iniezione o se si notano bolle d'aria - in tal caso, preparare una nuova siringa. Quando si estrae con cautela la siringa, ruotarla leggermente. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- OPZIONALE: Codifica l'animale sulla coda o sull'orecchio a seconda delle procedure locali (facoltativo ma facile in quanto l'animale è incosciente).
- Trasferire l'animale in una nuova gabbia, che viene posizionata per metà sopra e per metà su un termoforo (35-40 °C) durante il recupero dall'anestesia. Non lasciare gli animali incustoditi fino a quando non hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere la decubito sternale.
NOTA: Gli animali possono essere nuovamente alloggiati in gruppo dopo la guarigione (gli animali infetti non vengono mescolati con animali finti infetti). I topi infetti non devono essere alloggiati nella stessa stanza dei topi non infetti.
- Tieni traccia del peso dei topi per i primi 7 giorni dopo l'infezione poiché perdono peso dopo l'infezione e potrebbero richiedere un'alimentazione aggiuntiva.
2. Monitoraggio delle crisi epilettiche indotte dalla manipolazione
- Eseguire questa procedura da uno sperimentatore all'oscuro del trattamento. Porta tutte le gabbie in panchina. Osservare gli animali per le convulsioni 2 volte al giorno durante la fase di luce.
- Valutare l'attività convulsiva con una scala di Racine modificata: 0 = nessun cambiamento nel comportamento, 1 = movimenti della bocca e del viso, 2 = annuire con la testa, 3 = clono unilaterale dell'arto anteriore, 4 = clono bilaterale dell'arto anteriore con impennamento, 5 = attività tonico-clonica generalizzata con perdita del tono posturale, a volte salto, 6 = salto prolungato ed eccessivo e iperattività. Segnala il numero e l'intensità delle convulsioni.
- Fai scorrere una penna sulla gabbia per fare un po' di rumore.
- Trasferisci ogni animale in un'altra scatola e torna indietro.
- Scuotere delicatamente la gabbia con un movimento avanti e indietro, facendo attenzione a non scuotere la gabbia così energicamente che gli animali colpiscano i lati o la parte superiore della gabbia e corrano il rischio di subire lesioni fisiche.
- Monitorare tutti gli animali nella gabbia per verificare la presenza di convulsioni. In qualsiasi momento, se un topo ha una crisi, trasferiscila di nuovo nella gabbia di casa e annota il livello della crisi senza ulteriore stimolazione della crisi con il rumore o la manipolazione.
- Per gli animali che non si sono aggrapparti spontaneamente o dopo un leggero scuotimento della gabbia, scatenare le convulsioni con una manipolazione più intensa: girare con cautela il topo girandolo con la coda da sinistra a destra.
NOTA: Gli animali con convulsioni sono ipereccitabili e possono essere nervosi.
- Osserva nuovamente ogni animale per il comportamento convulsivo. Ripetere il processo per le gabbie successive.
