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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione della soluzione di lisofosfatidilcolina (LPC)
- Sciogliere 25 mg di polvere di LPC (vedere la tabella dei materiali) con 250 μl di soluzione mista di cloroformio e metanolo (1:1) per ottenere una soluzione di LPC al 10% e trasferirla in una provetta da centrifuga da 500 μl.
NOTA: Se l'LPC non è completamente disciolto, posizionare la provetta da centrifuga in un pulitore a ultrasuoni e ultrasuoni a 40 kHz per ~1 ora per ottenere una soluzione uniforme.
- Dividere la soluzione in 3 μL/provetta e conservare a −80 °C.
NOTA: La soluzione può essere conservata per ~2 anni.
- Prima dell'intervento chirurgico, diluire la soluzione (fase 1.2) con 27 μL di soluzione di cloruro di sodio (NaCl) allo 0,9% e mantenere la soluzione in un bagno d'acqua a temperatura costante a 37 °C.
NOTA: Preparare la soluzione appena prima di iniziare l'iniezione.
2. Preparazione chirurgica
- Utilizzare un ago da 32 g e 2 pollici per collegarlo a una siringa da 5 μl (vedere la tabella dei materiali). Assicurarsi che la siringa da microlitri non sia ostruita. Prelevare 5 μL di soluzione LPC per preparare l'iniezione.
- Anestetizzare il topo in una camera di induzione collegata a un vaporizzatore di isoflurano con isoflurano al 3% miscelato con ossigeno al 100% a una velocità di circa 0,3 L/min.
- Confermare la profondità dell'anestesia dalla mancanza di riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi mentre la respirazione è regolare.
- Rasare la testa del mouse tra le orecchie usando un rasoio elettrico. Applicare colliri lubrificanti per prevenire la secchezza corneale durante la procedura.
- Quindi, posizionare il mouse in una cornice stereotassica (vedi Tabella dei materiali) con il lato dorsale rivolto verso l'alto e fissare la testa con un cono e un morsetto per denti. Mantenere l'anestesia con isoflurano all'1,2%-1,6% attraverso il naso.
nota: La concentrazione di isoflurano può essere regolata in base allo stato respiratorio dei topi.
3. Procedura chirurgica
NOTA: Gli animali vengono posizionati su un termoforo durante tutte le procedure.
- Fissare il mouse all'apparato stereotassico con le barre auricolari bilaterali. Assicurarsi che le barre auricolari siano a livello e che la testa sia orizzontale e stabile.
- Disinfettare la pelle della testa strofinandola più volte con iodoforo, seguito da alcol con movimenti circolari. Quindi, un bisturi viene utilizzato per tagliare una piccola incisione di circa 1,5 cm lungo la linea mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio.
- Pulisci il cranio con un batuffolo di cotone imbevuto di perossido di idrogeno all'1% fino a quando la bregma, la lambda e la fontanella posteriore non sono esposte. Posizionare la siringa sull'apparato stereotassico.
NOTA: Utilizzare il perossido di idrogeno con cautela ed evitare di toccare i tessuti circostanti.
- Assicurarsi che la testa dell'animale sia in avanti che in quella posteriore e a sinistra e a destra.
- Regola la manopola dell'asse Z del telaio stereotassico in modo che la punta dell'ago e il cranio si tocchino senza piegarsi, quindi misura le coordinate dell'asse Z. Controlla le coordinate Z della bregma e della fontanella posteriore.
- Regolare la barra auricolare in modo che la differenza tra le coordinate Z della bregma e della fontanella posteriore non sia superiore a 0,02 mm. Quindi, segui lo stesso metodo per misurare le coordinate Z delle posizioni corrispondenti sui lati sinistro e destro della linea mediana. Regola la barra dell'orecchio per assicurarti che la sinistra e la destra siano allo stesso livello.
- Individua il corpo calloso. Impostare l'origine XYZ su bregma.
NOTA: Il primo sito di iniezione è di 1,0 mm lateralmente al bregma, profondo 2,4 mm e anteriore di 1,1 mm. Il secondo sito di iniezione è di 1,0 mm lateralmente alla bregma, profondo 2,1 mm e anteriore di 0,6 mm. Ad esempio, la coordinata della bregma è (0,0,0). Misura la coordinata Z della posizione corrispondente contrassegnata come (-1, 1.1, X) e (-1, 0.6, Y). Si può determinare che la prima coordinata del sito di iniezione del corpo calloso è (-1, 1,1, −[X + 2,4]) e il secondo sito di iniezione è (-1, 0,6, −[Y + 2,1]).
- Una volta determinato il sito di iniezione, fare un segno con un pennarello sterile sul cranio e registrare le coordinate.
- Forare delicatamente il sito contrassegnato con un trapano per cranio (vedi Tabella dei materiali). Fare attenzione a evitare qualsiasi sanguinamento.
- Spostare lentamente l'ago alle coordinate indicate e iniziare l'iniezione. Per indurre la demielinizzazione del corpo calloso, iniettare 2 μL di soluzione di LPC (fase 1.2) in ciascun sito di iniezione (fase 3.5.) a una velocità di 0,4 μL/min.
- Dopo l'iniezione, tenere l'ago in ogni sito per altri 10 minuti
NOTA: Assicurarsi che l'intervallo di due iniezioni non sia superiore a 20 minuti.
- Sutura la pelle con una sutura 4-0 e attendi che l'animale si svegli entro 10 minuti. Somministrare analgesici dopo l'intervento in conformità con le normative istituzionali sulla cura degli animali.
NOTA: Il tempo consigliato per l'eutanasia può essere determinato in base allo scopo dell'esperimento.