$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di soluzioni di emoglobina e liquido cerebrospinale
- Preparare una soluzione sterile di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) aggiungendo 500 μl della soluzione di aCSF a una microprovetta da 1,5 mL e conservare in ghiaccio.
- Preparare una soluzione sterile di emoglobina da 150 mg/mL aggiungendo 75 mg di emoglobina a 500 μL di aCSF in una microprovetta da 1,5 mL e conservare in ghiaccio.
2. Preparazione dell'animale per l'iniezione
- Ruotare il termoforo sull'impostazione media per mantenere la temperatura corporea del ratto.
- Anestetizzare i ratti postnatali del giorno 4 (P4) in una camera di induzione riempita con isoflurano al 3%.
nota: Confermare un'anestesia sufficiente utilizzando la risposta di pizzicamento della punta/coda ogni 15 minuti. Monitorare l'anestesia con l'osservazione visiva del colore dei tessuti, della temperatura corporea e della frequenza respiratoria.
- Somministrare sollievo dal dolore con un'iniezione sottocutanea di carprofene da 5 mg/kg al ratto anestetizzato.
- Posizionare il ratto anestetizzato prono nell'apparato stereotassico con il naso posizionato nell'adattatore per anestesia con un flusso costante di isoflurano all'1,5%.
- Stringere le barre auricolari non rotture sul meato uditivo esterno per fissare la testa.
nota: Applicare un unguento veterinario per mantenere gli occhi idratati se gli occhi sono aperti all'età dell'iniezione.
- Pulire la testina, alternandola con applicatori sterili con punta in cotone imbevuti di betadina ed etanolo al 70%.
- Toccare l'applicatore imbevuto di betadina al centro del cuoio capelluto e stendere la betadina in cerchi, spostandosi verso l'esterno.
- Ripetere il passaggio 2.6.1.1 con l'applicatore imbevuto di etanolo.
- Ripetere il passaggio 2.6.1.1 e il passaggio 2.6.1.2 3 volte.
- Applicare un telo chirurgico sterile per proteggere il campo operatorio.
- Usando un bisturi sterile, praticare un'incisione di 0,3 cm verticalmente lungo il centro della testa per esporre il bregma del cranio><.
nota: Se si inietta dalla lambda, esporre la lambda del cranio invece del bregma.
- Utilizzare un applicatore sterile con punta di cotone per asciugare l'area.
3. Impostazione dell'iniettore stereotassico
- Aspirare la soluzione di emoglobina preparata al punto 1.2 in una siringa sterile da 0,3 ml con un ago da 30 G e posizionare la siringa nel sistema di iniezione stereotassico.
nota: Se si generano condizioni di controllo, aspirare la soluzione di aCSF preparata al punto 1.1 in una siringa sterile da 0,3 mL e procedere con il protocollo.
- Attiva l'interfaccia dell'iniettore stereotassico e fai clic sul pulsante Configurazione per inserire le impostazioni del volume e della velocità di iniezione.
- Fare clic su Volume e impostare il volume a 20.000 nL (20 μL).
- Fare clic su Velocità di infusione e impostare la velocità a 8.000 nL/min (8 μL/min).
- Uscire dalla configurazione facendo clic sul pulsante Reset Pos.
- Sciacquare la punta dell'ago facendo clic sul pulsante Infondere fino a quando una piccola goccia di soluzione di emoglobina non fuoriesce dalla punta dell'ago.
- Assorbire delicatamente la soluzione di emoglobina dalla punta dell'ago con un applicatore sterile con punta di cotone.
4. Iniezione animale
- Impostare il bregma su zero sul sistema di iniezione stereotassica regolando le posizioni mediolaterale e anteroposteriore della siringa prima di abbassare la punta dell'ago della siringa lavato per toccare delicatamente il cranio in corrispondenza del bregma.
nota: Se si esegue l'iniezione dalla lambda, impostare lambda su zero.
- Identificare le coordinate scelte.
- In caso di iniezione dal bregma, nei ratti P4 qui descritti, utilizzare 1,5 mm lateralmente, 0,4 mm anteriori e 2,0 mm di profondità dal bregma.
- Se si inietta dalla lambda, utilizzare le seguenti coordinate per i ratti P4: 1,1 mm lateralmente, 4,6 mm anteriori e 3,3 mm di profondità dalla lambda.
- Sollevare l'ago della siringa di 1 cm sopra il cranio per liberare il cuoio capelluto. Quando la siringa è sollevata, procedere all'impostazione delle coordinate mediolaterale e anteroposteriore.
- Abbassare l'ago della siringa per toccare delicatamente il cranio. Controlla che l'ago tocchi il cranio.
- Impostare la coordinata dorso-ventrale su un periodo di 30 s.
nota: Durante l'impostazione della coordinata dorso-ventrale, l'ago forerà il cranio. Bisogna fare attenzione per garantire che la siringa passi attraverso il cranio senza deformare il cranio. La deformazione del cranio viene evitata ritirando lentamente l'ago lungo la coordinata dorso-ventrale se si verifica una deformazione, quindi riposizionando l'ago lungo la stessa traiettoria. Ciò consente all'ago di passare attraverso il foro nel cranio con meno forza e senza deformazioni.
- Nell'interfaccia dell'iniettore stereotassico, fare clic sul pulsante Esegui per iniziare l'iniezione.
- Al termine dell'iniezione, lasciare l'ago della siringa in posizione per 2 minuti per ridurre al minimo il riflusso della soluzione.
- Estrarre la siringa lentamente lungo la coordinata dorso-ventrale per 2 minuti fino a quando la punta dell'ago si trova a 2 cm sopra il cuoio capelluto.
- Ruotare il braccio dell'iniettore stereotassico lontano dal campo operatorio.
5. Assistenza postoperatoria
- Chiudere il cuoio capelluto con una sutura monofilamento 6-0. Eseguire una semplice sutura interrotta al centro dell'incisione di 0,3 cm.
- Rimuovi il cucciolo dall'anestesia e posizionalo su un'area sicura del termoforo.
- Riporta il roditore nella gabbia di casa per riprendersi dall'anestesia sotto la cura della sua madre.
nota: Il ritorno tempestivo alle cure della diga riduce la mortalità postoperatoria precoce.
- Monitorare gli animali per l'anestesia mediante perdita del riflesso di raddrizzamento ogni ora dopo l'intervento chirurgico per 3 ore.
- Monitorare gli animali ogni giorno per 7 giorni per verificare la normale attività, l'assunzione di cibo e l'aumento di peso. Monitorare il sito dell'incisione per la guarigione della ferita, la chiusura e la ricomparsa del pelo nel sito dell'intervento chirurgico.
nota: Nel raro caso in cui durante il monitoraggio si osservino cambiamenti neurologici come convulsioni, depressione centrale o diminuzione dell'appetito, sopprimere l'animale utilizzando la perfusione intravascolare o la lussazione cervicale in anestesia.
- Per prevenire l'infezione una volta che la sutura è chiusa e la ferita sta guarendo, applicare un triplo antibiotico topico nel sito dell'incisione.