Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione per il test di crisi epilettiche indotte dal calore
- Accendere il pulsante di accensione sulla camera termica, seguito dal pulsante di accensione del calore.
- Impostare la temperatura della camera termica a 50 °C utilizzando la tastiera del regolatore di temperatura digitale.
- Attendere almeno 1 ora per preriscaldare la camera a 50 °C prima di introdurre il primo topo nella camera. Il preriscaldamento garantisce un riscaldamento uniforme all'interno della camera.
- Rivesti il pavimento della camera termica del topo con lettiera di pannocchie.
- Montare una telecamera di registrazione video davanti alla camera di calore per registrare ogni prova di test di crisi epilettica indotta dal calore.
- Foderare una capsula di Petri di 140 mm di diametro con spessi strati di carta velina e posizionarla sul ghiaccio per fungere da cuscinetto di raffreddamento.
nota: Al termine del test, i singoli topi verranno trasferiti sul pad di raffreddamento preraffreddato per aiutare ad abbassare la loro elevata temperatura corporea.
2. Preparazione del topo per il test di crisi epilettiche indotte dal calore
- Selezionare 10 topi adulti (P30-P40), 5 portatori della mutazione che causa l'epilessia e 5 dei compagni di cucciolata wild-type per il test di screening delle crisi epilettiche indotte dal calore.
nota: I topi wild-type, che non presentano alcuna mutazione che causa l'epilessia, non mostrano convulsioni indotte dal calore a temperature inferiori a 44 °C e fungono da gruppo di controllo.
- Pesare ciascun topo da utilizzare per il test di screening e registrarne il peso corporeo. Per il test devono essere utilizzati solo topi di peso pari o superiore a 15 g.
- Esamina un mouse alla volta nella camera di calore del mouse.
- Anestetizzare brevemente il topo per 10-15 s utilizzando alcune gocce di isoflurano sul fondo di una campana di vetro.
- Togli l'animale dalla campana di vetro e mettilo su un tovagliolo di carta.
- Assicurarsi che il mouse sia completamente anestetizzato controllando che il mouse non risponda a un pizzicamento nocivo delle dita.
- Rivestire la punta metallica della sonda di temperatura rettale con un lubrificante (come la vaselina) e inserirla delicatamente nel mouse a una profondità inferiore o uguale a 2 cm.
- Fissare la sonda rettale alla coda del topo con del nastro adesivo in modo che la sonda non fuoriesca durante il test.
nota: In alternativa, posizionare l'animale in un cono di contenimento per topi e inserire la sonda di temperatura rettale. Fissalo fissandolo con del nastro adesivo alla coda.
- Assicurarsi che la sonda rettale sia collegata a un multimetro che visualizzi la temperatura corporea interna del mouse.
- Metti l'animale in una gabbia fresca rivestita con lettiera di pannocchia, cioè la gabbia di recupero.
- Avvia un timer e attendi 5 minuti. Osserva il mouse fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia e il mouse è attivo e si sta toelettando.
- Contemporaneamente, monitorare la temperatura corporea interna del mouse fino a quando non si stabilizza a 35-36 °C.
- Al termine dei 5 minuti, annotare la temperatura corporea del mouse. Questa è la temperatura corporea iniziale al tempo "0" min.
nota: Se la temperatura corporea interna del topo è inferiore a 35 °C, attendere un ulteriore periodo di tempo affinché l'animale si riprenda dall'ipotermia indotta dall'anestesia.
- Trasferire rapidamente il singolo mouse nella camera del mouse preriscaldata. Questo segna l'INIZIO della prova dell'esperimento. Viene esaminato un solo mouse alla volta.
3. Saggio delle crisi epilettiche indotte dal calore
- Dopo aver posizionato delicatamente il mouse sul pavimento della camera termica del mouse preriscaldata, chiudere lo sportello in plexiglass e avviare la telecamera per la registrazione video dell'esperimento.
- Avvia il cronometro. Registrare la temperatura corporea del topo dal termometro rettale a intervalli di 1 minuto per tutta la durata dell'esperimento.
- A intervalli regolari, aumentare la temperatura della camera termica del topo in modo tale che la temperatura corporea del topo aumenti a una velocità di 0,25-0,5 °C /min.
nota: Rapidi aumenti della temperatura corporea possono portare a colpi di calore o morte e dovrebbero essere evitati.
- Seguendo questo protocollo, aumentare la temperatura della camera termica del topo di 5 °C ogni 10 minuti come mostrato nella Figura 1A.
- A 9.5 min, impostare la temperatura della camera di calore a 55 °C, per stabilizzare la temperatura della camera di calore a 55 °C entro il 10° minuto, come mostrato sul display digitale della temperatura.
- Allo stesso modo, aumentare la temperatura a 60 °C a 19,5 minuti per stabilizzare la temperatura della camera di calore a 60 °C entro il 20° minuto. Ogni prova di screening delle crisi dura 30 minuti.
- Se il topo ha un attacco epilettico (vocalizza, mostra la testa che annuisce, clono degli arti anteriori, estensione degli arti posteriori, cade su un fianco o sperimenta convulsioni toniche/cloniche generalizzate), registrare le seguenti informazioni.
- Registrare la temperatura corporea del topo durante la crisi (temperatura di soglia delle crisi) dal termometro della temperatura rettale.
- Registrare le caratteristiche del comportamento convulsivo come l'annuire della testa, il clono degli arti anteriori, l'estensione degli arti posteriori, la caduta laterale e/o le convulsioni toniche/cloniche generalizzate (GTCS) visualizzate dal topo.
- Raccogliere rapidamente ma delicatamente il mouse dalla camera e posizionarlo sul pad di raffreddamento preparato al punto 1.6.
nota: Se un topo sta sperimentando convulsioni di scala Racine 5 e mostra salti incontrollati, può essere difficile raccogliere l'animale dalla camera di calore e trasferirlo al cuscinetto di raffreddamento all'esterno. Tuttavia, una tipica crisi indotta dal calore dura tra i 30 e i 60 secondi. Pertanto, il topo deve essere estratto dalla camera di calore e messo sul cuscinetto di raffreddamento entro 60 secondi dall'inizio dell'episodio di crisi indotta dal calore.
- Attendere che la temperatura corporea del topo scenda a 36-37 °C, prima di trasferirlo in una gabbia di recupero. In una gabbia di recupero viene inserito un solo topo alla volta.
nota: Non mischiare topi che devono ancora essere utilizzati per lo screening indotto dal calore con il topo che ha già sperimentato la prova dell'esperimento di convulsioni indotte dal calore.
- Delicatamente e con attenzione, tagliare il nastro tra la coda del topo e il filo della sonda rettale con un paio di forbici per rimuovere la sonda rettale dal mouse.
- Pulire la punta metallica della sonda rettale con alcol al 70% e salviette per tessuti molli per mantenerla pronta per la prova successiva.
- Continuare a osservare il topo nella gabbia di recupero fino a quando non riprende la normale attività (camminare, pulirsi, ecc.), prima di riportare il topo nella gabbia di casa. Questo segna la FINE della prova dell'esperimento per questo mouse.
- Registrare lo stato dell'animale dopo il test vivo e recuperato dalla sessione di test o morto. Convulsioni ad alta intensità che coinvolgono salti incontrollati e convulsioni toniche/cloniche generalizzate possono talvolta provocare la morte del topo.
- Se un topo non manifesta convulsioni indotte dal calore entro il periodo di osservazione di 30 minuti o la temperatura corporea del topo raggiunge i 44 °C, rimuovere il topo dalla camera di calore e posizionarlo sul cuscinetto di raffreddamento fino a quando la temperatura corporea del topo non torna a 36-37 °C.
- Ripristinare la temperatura della camera termica del mouse a 50 °C e lasciarla equilibrare fino a quando la temperatura visualizzata sul regolatore di temperatura digitale mostra 50 °C.
- Cambia la lettiera di pannocchia tra le prove individuali sui topi.
