Tutte le procedure che coinvolgono campioni di animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato.
1. Colorazione dell'anticorpo primario e della biocitina
(Giorno 1)
NOTA: La seguente procedura di immunocolorazione è per sezioni a fluttuazione libera e richiede un'agitazione continua a bassa velocità (2 giri/min, giri/min) su un agitatore per tutte le fasi di incubazione.
- Lavare il fazzoletto 3 volte per 10 minuti ciascuno a 0,1 M PBS (pH = 7,4).
NOTA: 0,1 M PBS può essere acquistato commercialmente o prodotto in laboratorio come segue (per 1 L): 8 g di NaCl, 0,2 g di KCl, 1,44 g di Na2HPO4 e 0,24 g di KH2PO4 in 1 L di dH2O.
NOTA: Se il marcatore neurochimico desiderato è noto, la colorazione per una proteina/peptide può essere eseguita contemporaneamente alla colorazione con biocitina (passaggi 1.2 - 1.4). Se si colora solo per la biocitina, procedere al passaggio 1.5.
- OPZIONALE: Bloccare con il 10% di siero bloccante (BS; siero normale di capra (NGS) diluito in Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 1 ora a RT).
NOTA: Ogni pozzetto dovrebbe ricevere lo stesso volume della soluzione; il volume raccomandato è compreso tra 250 e 500 μL/pozzetto. La selezione del siero bloccante si basa sulla specie in cui vengono allevati gli anticorpi secondari ( ad esempio, NGS viene utilizzato per gli anticorpi di capra coniugati con colorante (rispettive specie di anticorpi primari)). Se si presenta la necessità di utilizzare anticorpi secondari allevati in specie diverse per le sezioni di immunocolorazione, includere il 10% di ciascun siero normale nella fase di blocco (2) e il 3% di ciascun siero normale per le fasi di incubazione degli anticorpi primari e secondari.
- (FACOLTATIVO) Incubare le sezioni nell'anticorpo primario, CB1R (policlonale, cavia), con 0,3% di Triton X-100 e 3% di BS in 0,1 M PBS a RT O/N. CB1R viene utilizzato per identificare l'espressione del recettore dei cannabinoidi di tipo 1.
NOTA: Questo passaggio è facoltativo e non è necessario per rivelare il riempimento di biocitina. La Figura 2 illustra una sezione etichettata per la biocitina e il CB1R durante il primo processo di colorazione. L'incubazione di O/N alla RT è sufficiente per la maggior parte degli anticorpi primari; tuttavia, alcuni anticorpi primari, tra cui CB1R, richiedono 3-5 giorni di incubazione. Se l'incubazione deve essere più lunga di 1 giorno, si consiglia di incubare a 4 °C perché Triton X-100 può permeabilizzare le fette e può portare alla disintegrazione del tessuto durante l'incubazione prolungata a temperatura ambiente. Includere un controllo negativo privo di un anticorpo primario in almeno una sezione per ogni serie di esperimenti come controllo per la specificità dell'anticorpo secondario. Per i controlli negativi, l'anticorpo primario viene omesso, ma viene aggiunto il Triton X-100 allo 0,3% in 0,1 M PBS e BS.
(Giorno 2)
- Lavare le sezioni cerebrali 3 volte per 10 minuti ciascuna in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Incubare le sezioni in coniugato colorante rosso streptavidina (concentrazione: 1:1.000; eccitazione: 594 nm con emissione nello spettro rosso visibile) con Triton X-100 allo 0,3% e BS al 3% in PBS 0,1 M a 4 °C O/N al buio (avvolto in un foglio di alluminio) per rivelare la biocitina. FACOLTATIVO: Includere un anticorpo secondario, capra anti-cavia (concentrazione: 1:500; eccitazione: 488 nm ed emissione in verde), con l'incubazione di cui sopra dopo l'incubazione primaria facoltativa nel passaggio 1.3.
NOTA: Un anticorpo secondario sarà necessario solo se viene eseguita la colorazione opzionale dell'anticorpo primario (passaggio 1.3). Per visualizzare la biocitina, si raccomanda un coniugato streptavidina-fluoroforo con uno spettro di emissione in rosso, in quanto aiuta a visualizzare gli assoni più fini in dettaglio e con un migliore contrasto (Figure 1 - 3).
(Giorno 3)
- Lavare le sezioni cerebrali 3 volte per 10 minuti ciascuna in 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Per proteggere la fluorescenza e facilitare la ricolorazione in futuro, montare le sezioni in un mezzo di montaggio a base acquosa e sigillare i bordi del vetrino coprioggetti con smalto trasparente.
NOTA: È meglio colorare le sezioni il prima possibile per evitare difficoltà a rimuovere lo smalto dal vetrino, infestazione di muffa e disidratazione dei tessuti a causa del mezzo di montaggio che fuoriesce dal vetrino. La contaminazione microbica può essere prevenuta utilizzando l'azide di sodio allo 0,02% nel PBS.
ATTENZIONE: L'azoturo di sodio è altamente tossico e infiammabile quando è a contatto con l'acqua. Fare riferimento alle procedure operative standard per la manipolazione e lo smaltimento di sostanze chimiche pericolose.
(Giorni 4 - 7)
- Eseguire l'imaging confocale con eccitazione a 594 e 488 nm e con un ingrandimento di 20X o 40X per rivelare i neuroni pieni di biocitina in rosso e i marcatori neurochimici (CB1R) in verde. Valutare la coetichettatura (Figura 2).
- Impostare l'esposizione della fotocamera a meno di 100 ms per evitare il fotobleaching e ottenere stack di immagini confocali degli arbori assonale e dendritico dell'intero neurone. Utilizza stack di immagini confocali e pacchetti software di tracciamento dei neuroni per ricostruire la morfologia neuronale.
