1. Preparazione delle sezioni di biopsie per aspirazione rettale (RSB)
- Posizionare le biopsie di aspirazione rettale in paraformaldeide al 4% per 6 ore per fissare il tessuto. Utilizzare un volume fissativo 5 volte superiore al volume del tessuto.
- Disidratare il tessuto utilizzando l'essiccatore tissutale patologico per 11 ore. L'intero processo programmato consiste nelle seguenti 5 fasi:
- Mettere il fazzoletto in formaldeide e fissarlo per 1 ora.
- Mettere il fazzoletto in etanolo al 75% per 4 ore.
- Porre il tessuto in etanolo assoluto (due cambi, 1 ora ciascuno).
- Mettere il fazzoletto in etanolo assoluto (due cambi, 30 minuti ciascuno).
- Mettere il fazzoletto nello xilene (tre cambi, 1 ora ciascuno).
- Immergere il fazzoletto in cera di paraffina (58-60 °C) (tre cambi, 1 ora ciascuno). Incorporare i tessuti RSB in blocchi di paraffina.
- Tagliare i blocchi di paraffina utilizzando un microtomo fino a quando il tessuto non è completamente esposto con un piano di sezione completo.
- Tagliare i blocchi in sezioni da 0,4 μm con un microtomo.
- Immergere le sezioni in acqua a 45-50 °C per alcuni secondi ciascuna per consentire alle sezioni di diffondersi in un piatto piano.
- Trasferire le sezioni di paraffina sui vetrini.
- Cuocere i vetrini in forno a 60 °C per 3-5 ore. Evitare di cuocere troppo a lungo, che potrebbe portare alla perdita degli antigeni.
- Posizionare i vetrini deparaffinizzati nello xilene (2 cambi, 15 minuti ciascuno).
- Idratare i vetrini in etanolo assoluto, etanolo al 95%, 80% e 75% per 5 minuti ciascuno. Quindi, sciacquarli in acqua purificata con osmosi inversa (RO) per altri 5 minuti.
2. Recupero dell'antigene
- Effettuare diluizioni di lavoro per il recupero della calretinina mescolando 4 mL di tampone per il recupero dell'antigene dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) con 200 mL di acqua purificata da RO. Effettuare diluizioni di lavoro per il recupero di S100 e Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) mescolando 1 mL di tampone citrato di sodio acido citrico (100x) con 99 mL di acqua purificata con RO.
NOTA: La calretinina può essere recuperata preferenzialmente con la soluzione di recupero EDTA. Tuttavia, il tampone citrato di sodio acido citrico è più adatto per il recupero di S100 e PGP9.5.
- Metti i vetrini in un barattolo per colorare Coplin. Riempi il barattolo con la soluzione di recupero e mettilo in un bagnomaria bollente preriscaldato. Dopo aver fatto bollire per 20 minuti, togliete il barattolo dal bagnomaria e lasciatelo raffreddare a temperatura ambiente. Il processo di raffreddamento dura circa 10 minuti. Rimuovere i vetrini e sciacquarli delicatamente una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Disegna un cerchio con un pennarello attorno al fazzoletto e prepara una scatola bagnata per le seguenti procedure.
3. Blocco
- Effettuare diluizioni di lavoro mescolando 3 mL di 30% H2O2 con 27 mL di acqua purificata con RO.
- Far cadere due o tre gocce di soluzione al 3% di H2O2 goccia per goccia sul tessuto per bloccare le perossidasi. Aggiungere prontamente la soluzione H2O2 per assicurarsi che non trabocchi dal cerchio. Bloccare le perossidasi in un'incubatrice a 37 °C per 20 minuti.
- Sciacquare delicatamente i vetrini con PBS (tre lavaggi, 5 minuti ciascuno).
- Bloccare i vetrini per 20 minuti a 37 °C con albumina sierica bovina al 5% (BSA, preparata mescolando 1,5 g di polvere di BSA con 30 mL di acqua purificata con RO).
NOTA: Il blocco con perossido di idrogeno al 3% può prevenire il 95% delle colorazioni aspecifiche e il blocco con il 5% di BSA può prevenire l'altro 5% delle colorazioni aspecifiche. Combina i due metodi per ottenere un risultato affidabile.
4. Reazione antigene-anticorpo
- Rimuovere il 5% di BSA e aggiungere 50 μl di anticorpo primario (calretinina, S100 o PGP9.5) al vetrino. Incubare per una notte a 4 °C.
- Lavare il vetrino con PBS (tre volte, 3 minuti ciascuna).
- Aggiungere 50 μl di potenziatore del polimero (reagente A; vedere la Tabella dei materiali) alla sezione e incubarla per 20 minuti in un incubatore a 37 °C. Quindi, lavare il vetrino con PBS (tre volte, 3 minuti ciascuna).
- Aggiungere 50 μl di anticorpo secondario B (anticorpo secondario IgG di capra/coniglio/topo) alla sezione e incubare per 30 minuti in un'incubatrice a 37 °C. Lavare la sezione con PBS (tre volte, 5 minuti ciascuna).
5. Colorazione con 3,3-diaminobenzidina ed ematossilina
- Aggiungere 850 μL di acqua purificata con RO in una provetta da 1,5 mL e aggiungere i reagenti di colorazione (vedere la Tabella dei materiali) nell'ordine A, B e C. Aggiungere 50 μl di ciascun reagente per ottenere un totale di 1 mL di soluzione di lavoro 3,3-diaminobenzidina (DAB). Se ci sono precipitati, utilizzare la soluzione dopo la filtrazione.
- Aggiungere una goccia di soluzione di lavoro DAB alla sezione di tessuto e colorare per 3-10 minuti. Incubare i vetrini in DAB a temperatura ambiente fino a quando non viene rilevata una colorazione marrone. Monitorare attentamente utilizzando un microscopio a campo chiaro. Tenere la soluzione di lavoro DAB al riparo dalla luce. Quindi, lavare il vetrino con PBS per 5 minuti.
- Aggiungere una goccia di ematossilina per controcolorare i nuclei per circa 1 minuto. Quindi, tieni il barattolo di coplin e lavalo sotto un filo d'acqua per circa 30-40 s fino a quando il colorante in eccesso non viene rimosso. Fare attenzione a non danneggiare le sezioni di tessuto.
- Immergere i vetrini RSB in un barattolo di coplin contenente PBS per 25-30 s. Quindi, differenziare in acido cloridrico-etanolo all'1% per 10 s. Lavare i vetrini con PBS per 1 minuto.
- Disidratare i vetrini nell'ordine inverso di idratazione: 75%, 80%, 95% ed etanolo assoluto (5 minuti ciascuno).
- Esporre i vetrini allo xilene (2 modifiche, 5 minuti ciascuna).
- Montare il vetrino coprioggetti utilizzando il montaggio ultraclean. Lasciare asciugare i vetrini prima di visualizzarli al microscopio.